離とナイーブCD4 Tリンパ球のTh17分化
Summary
他のT細胞サブセットとは異なるエフェクター機能を持つ、Th17細胞は、中央炎症性自己免疫に関与している。このインビトロのTh17分化プロトコルは、ナイーブCD4 + Tリンパ球は、Th17細胞に分化することができ、さらに自己免疫および宿主応答におけるそれらの役割を検討するかどうかを決定するための手段を提供する。
Abstract
Th17細胞は、インターロイキン17（IL-17）を産生することが見出されているT細胞の別個のサブセットである、およびTh1、Th2の、および調節T細胞を含む他のT細胞サブセットの機能が異なる。 Th17細胞は、多くの自己免疫疾患に関連した熱心炎症性免疫応答において中心的な原因として浮上している。この方法では、C57BL / 6マウスの脾臓およびリンパ節からのTリンパ球を精製し、制御およびTh17分化を誘導する環境下での精製されたCD4 + T細胞を刺激する。 Th17分化を誘導する環境を、抗CD3および抗CD28抗体、IL-6、およびTGF-βの存在下での刺激を含む。少なくとも72時間、および37℃で最長5日間インキュベートした後、細胞を、続いてフローサイトメトリー、定量PCRおよびELISAを介してIL-17を産生する能力について分析する。 Th17の分化CD4 + CD25-T細胞はさらに、Th17細胞が自己免疫およびホスト·ドの発症および進行に果たす役割を解明するために利用することができる国防。また、個別のマウスノックアウト/疾患モデルからのCD4 + CD25 – リンパ球のTh17の分化は、細胞運命の可塑性の我々の理解に貢献することができます。
Introduction
CD4 + Tリンパ球（T細胞）は、感染性微生物に対する免疫系媒介性防御において重要な役割を果たしている。逆に、T細胞はまた、密接に1型糖尿病、全身性エリテマトーデス、関節リウマチなどの自己免疫疾患の発症および進行に関連している。 CD4 + Tリンパ球は、T細胞受容体、同族抗原/主要組織適合複合体II（MHCII）の分子と（TCR）相互作用の組み合わせによって活性化され、B7.1/B7.2でCD28受容体の相互作用は15リガンド 。 TCR刺激およびCD28共刺激の提供に加えて、抗原提示細胞は、それによって所与の抗原に対するTリンパ球の応答を導く、Tリンパ球の分化状態を決定するサイトカイン環境を提供する。異なる病原体/抗原提示細胞の相互作用は、イーライに焦点を当てた別個の経路をTリンパ球をダウンスキュー異なるサイトカイン環境を作成する開始病原体のmination。残念ながら、元々の病原体を根絶するために設計された侵入するTリンパ球のエフェクター経路は、誤って自己組織15に向けることができる。したがって、各別個のCD4 + T細胞サブセットの分化状態のより良い理解は、病原体の排除と自己に対する寛容とのバランスを調節する方法についての我々の理解に重要である。
のTh1、Th2の、および誘導性調節性T細胞分化経路に加えて、ナイーブTリンパ球はまた、ダウン経路のTh17サイトカインにより駆動することができる。 Th1細胞は細胞内病原体戦闘一方、Th2細胞は、細胞外病原体を排除し、調節性T細胞（Tregs）は、炎症応答1,16を最小限に抑える、Th17細胞は、細胞外細菌および真菌の排除に重要な役割を果たしている。 Th17細胞は、一般に、系統特異的転写因子であるRORγtの発現およびILの産生を付しているマクロファージおよび好中球1,7の活性化を促進-17A、。
Th17細胞は、幾つかの自己免疫疾患、およびそれらに関連するげっ歯類モデルに関与している。例えば、それはIL-23（Th17の表現型を維持するために必要とされる）ことが実証されているではなく、IL-12、実験的自己免疫性脳炎（EAE）におけるMSのための齧歯類疾患モデル中央犯人であった。それは、その後、IL-17産生の減少がEAEの予防2、6、17に相関することが示されている。また、Th17細胞は、関節炎および全身性エリテマトーデス（SLE）10、16を含む他の自己免疫疾患と関連している。 IL-23 のp19欠損– / –マウスTh17細胞の非常に低い数値を有することが示されており、EAEだけでなく、現像に耐性であるが、コラーゲン誘導関節炎、関節リウマチ10,18のモデルをした。加えて、マウスは、後方にIL-17Aの中和抗体で処置小胞体コラーゲン誘導関節炎の発症はまた、関節損傷18の分解能を有することが見出された。なお、最近の研究はまた、1型糖尿病9,11および腸炎症14におけるTh17細胞の保護的役割が示されているような自己免疫疾患の進行におけるTh17細胞の役割は特徴付けされないままであることに留意されたい。これらの研究は、自己免疫におけるTh17の分化の重要性を確認。
さらなる調査が必要で、少なくとも2困惑の質問があるので、 体外のTh17分化の T細胞の研究に必要なメソッドです。1）どのように正確に、IL-6は、Treg細胞とTh17の分化との間のバランスを調節しないと、2）正確なメカニズムは何ですかIL-17誘導性の炎症性疾患の背後にある？我々の方法は、C57BL / 6マウスの脾臓およびリンパ節からのCD4 + CD25-T細胞を使用する。なお、留意することが重要であることは、不純を使用してTh17の分化を誘導することが可能であるが集団は、少なくとも80％純粋なCD4 + CD25-T細胞の集団を取得することにより、汚染の心配を否定し、より成功のTh17分化の結果を確実にする。適切なTh17の分化を達成するために、CD4 + CD25-T細胞を、それぞれ、抗CD3および抗CD28、活性化シグナルを提供する、1および2の存在下でインキュベートし、IL-6、およびTGF-β。それはIL-23単独ではTh17の分化を達成するために用いることができることが報告されているが、これは後でIL-23がTh17分化細胞集団の安定性のために必要であることが実証されたが、IL-6およびTGF-βは、Th17細胞の分化に必須である3、18、19。マウスの研究は、IL-23受容体は、それらがIL-6およびTGF-β13,18で刺激された後にのみCD4 + T細胞上で発現されることを示した。また、Th17細胞が正常であればIL-6およびTGF-β18,19存在するようなIL-23遮断抗体の存在下で発症する。このように、本のTh17分化プロトコルPROV正常のTh17分化を誘導するために適切な条件をIDES。 Th17の分化のメカニズムのよりよい理解を開発し、IL-17産生が自己免疫疾患13を目的とした、より良い治療法の開発のための機会を提示する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここでは、 インビトロでのTh17分化を達成するためのプロトコルを記載している。のTh17サブセットへのTリンパ球の分化はヒト病原体13の効果的な除去のために重要であるとしてのTh17分化の研究は、重要です。逆に、IL17産生は、自己免疫疾患の進行13と関連している。それは、免疫調節および自己免疫の多数の異なるマウスモデルに適用することができるように、Th17の?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、フロリダ大学のTL1 TR000066とUL1 TR000064、国立衛生研究所、BDバイオサイエンス試薬の助成金、および大学からの親グラントR01AI056152からダイバーシティ·補完するために、NIH / NCATS臨床およびトランスレーショナル科学賞によって部分的にサポートされていますフロリダ州。
Materials
| Reagent/Material | |||
| Sterile Polyestrene Petri Dish | Fisher Scientific | 0875713A | 60 mm x 15 mm |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| Premium Microscope Slides, Frosted | Fisher Scientific | 12-544-3 | 3″ x 1″1 mm |
| 5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle | BD Biosciences | 309632 | |
| Corning 15 ml Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | CLS430791 | |
| Nylon 40 microns | Miami Aquaculture | Nylon 40/26 | |
| Microtest tissue culture plate 96 well U bottom | BD Biosciences | 35-3077 | |
| Corning Costar 24 well cell culture plates | Sigma-Aldrich | CL3524 | |
| Eppendorf Tubes 1.5 ml | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e | BD Biosciences | 553057 | |
| Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28 | BD Biosciences | 553294 | |
| Mouse IL-6 Recombinant Protein | eBioscience | 14-8061-62 | |
| TGFbeta | R&D Systems | 240-B-002 | |
| Trypan blue solution 0.4 % | Sigma-Aldrich | 66H2364 | |
| Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4 | BD Biosciences | 558107 | |
| APC Rat Anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 553035 | |
| PE Conjugated Anti-mouse CD25 | eBioscience | E01155-516 | |
| Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17 | BD Biosciences | 560820 | |
| Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse | BD Biosciences | 51-2041AK (559311) | |
| MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| ABAM | Cellgro | 30-004-CI | |
| RPMI | Corning, Cellgro | 10-040-CM | |
| B 2-MercaptoEthanol | MP Biomedical | 194834 | Hazardous |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | |||
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909-1ML | Hazardous |
| Brefeldin A (BFA) | MP Biomedicals | 159027 | |
| ELISA IL-17A Capture mAb | BD Biosciences | 555068 | |
| ELISA IL-17A Detection mAb | BD Biosciences | 555067 | |
| ELISA IL-17A Standard | eBioscience | 14-8171-80 | |
| IL-2 ELISA Kit | BD Biosciences | 555148 | |
| TMB Substrate Reagent Set | BD Biosciences | 555214 | |
| Equipment | |||
| autoMACS Pro Cell Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Sorvall Legend RT+ Centrifuge | ThermoScientific | ||
| Napco series 8000 WJ CO2 Incubator | ThermoScientific | ||
| PTC-200 Peltier Thermal Cycler | Biorad |
References
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