Multiplexed Люминесцентная микрочипов для человека слюнных анализа белка с использованием полимерных микросфер и волоконно-оптических Связки
Summary
Мы описываем процедуру для профилирования белки слюны, используя мультиплексированных массивы антител микросфер на основе. Моноклональные антитела ковалентно связаны с флуоресцентными красителями кодируется 4,5 мкм полимерных микросфер с использованием карбодиимида химии. Модифицированные микросферы были депонированы в волоконно-оптических лунки для измерения уровня белка в слюне с помощью сэндвич-флуоресценции иммунологические.
Abstract
Здесь мы опишем протокол для одновременного измерения шесть белков в слюне с помощью микросфер на основе массива антител оптоволоконный. Технология иммуно-массив использованы сочетает в себе преимущества микросфер на основе подвески изготовления матрицы с использованием флуоресцентной микроскопии. Как описано в протоколе видео, коммерчески доступные 4,5 мкм полимерные микросферы были закодированы в семи различных типов, различаемых по концентрации двух флуоресцентных красителей физически ловушке внутри микросфер. Кодированные микросферы, содержащие поверхностные карбоксильные группы были изменены с помощью моноклональных антител захвата через EDC / NHS связи химии. Для сборки белка микрочипов, различные типы кодированных и функционализированных микросфер были смешаны и случайным образом на хранение в 4,5 мкм лунки, которые были химическому травлению на проксимальном конце волоконно-оптического пучка. Волоконно-оптический пучок был использован и как носителя и для визуализации мicrospheres. После сборки, микрочипов был использован для захвата белков в слюне супернатант собирали из клиники. Детектирование на основе сэндвич-иммуноанализа с использованием смеси биотинилированных антител обнаружения для различных аналитов с стрептавидином, конъюгированным флуоресцентного зонда, R-фикоэритрином. Микрочипов был сфотографирован с помощью флуоресцентной микроскопии в трех различных каналов, по два для регистрации микросфер и один для сигнала анализа. Флуоресцентные микрофотографии были затем декодируются и проанализированы с помощью самодельного алгоритм в MATLAB.
Introduction
С первого микрочипов сообщил Марк Schena и коллегами в середине 1990-х, этот мощный инструмент был использован во многих областях биологических исследований 1. Антитела микрочипы, способные одновременно обнаруживать несколько белков в диагностических жидкостей, таких как кровь, имеют важное применение в клинической диагностике и скрининге биомаркеров 2-10. Слюна, содержащий многие из тех же аналитов как кровь, была рассмотрена в качестве предпочтительной альтернативой крови, потому что сбор слюны является безопасным, неинвазивным, и может быть осуществлена с помощью минимально-квалифицированного медицинского персонала 11-13. В настоящее время мультиплексированный анализ белка с использованием образцов слюны ограничен несколькими важными факторами, в том числе низкой концентрации заданного анализируемого вещества 14 и широкого диапазона концентраций различных биомаркеров 15.
.При этом мы показали, анализ шести белков: сосудистый эндотелиальный фактор роста человека (VEGF), интерферон гамма-индуцированный белок 10 (IP-10), интерлейкин-8 (IL-8), эпидермальный фактор роста (EGF), матрица metallopeptidase 9 (ММП-9) и интерлейкина-1 бета (IL-1β) . Выполнение метода была первоначально проверена с использованием стандартных растворов рекомбинантных белков, составляющих анализируемого вещества и блокирующем буфере. Реальные образцы слюны, собранные от пациентов различных хронических заболеваний органов дыхания, а также здоровых были также проверены с удовлетворительной работы. Протокол должен быть применим и к другим белковых аналитов и других микросфер на основе анализов. Эта платформа дает значительные преимущества в области аналитической химии, так как позволяет быстро, точно, и воспроизводимое одновременный анализ низких концентрациях нескольких белков с широким динамическим диапазоном, минимальных неспецифических взаимодействий, снижение потребления образца, и низкой стоимости по сравнению с Аналогичный иммуноферментный анализ (ELISA).
Protocol
Representative Results
Discussion
Исследователи должны обратить особое внимание на следующие шаги: для большей точности декодирования, необходимо проверить эти микросферы равномерно приостановлено по всей инкубации и мыть шаги во время процедуры кодирования микросферы. Кроме того, кодированные микросферы должны бы?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальными Институтами Здоровья (грантов 08UDE017788-05). EBP также признает поддержку от испанского фонда по науке и технике (FECYT). Авторы благодарят Шонда Т. Gaylord и Pratyusha Mogalisetti за критическое прочтение рукописи.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
References
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Schena, M. . Protein Microarray. , (2004).
- Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays. J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).
- Wang, C. C., et al. Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines. J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).
- de Jager, W., Velthuis, t. e., Prakken, H., Kuis, B. J., W, G. T., Rijkers, Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers. Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).
- Vignali, D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).
- Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
- Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis. Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).
- Blicharz, T. M., et al. Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva. Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).
- Mukhopadhyay, R. Devices to drool for. Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).
- Wong, D. T. Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).
- Segal, A., Wong, D. T. Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better. Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).
- St John, M. A. R., et al. Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).
- Pantano, P., Walt, D. R. Ordered nanowell arrays. Chem. Mater. 8, 2832-2835 (1996).
- Schena, M. . Protein Microarrays. , (2005).
