הריבוב פלורסנט Microarray לניתוח חלבוני רוק אדם שימוש מיקרוסכמות פולימרים ואגדים של סיבים אופטיים
Summary
אנו מתארים הליך לאפיון חלבוני רוק באמצעות מערכי נוגדנים מבוססי microsphere מרובבים. נוגדנים חד שבטיים היו קשורים קוולנטית ל4.5 מיקרומטר זעירים מפולימר ניאון בקידוד צבע באמצעות הכימיה carbodiimide. Microspheres שונה הופקד בmicrowells סיבים אופטיים כדי למדוד את רמות חלבון ברוק באמצעות immunoassays כריך הקרינה.
Abstract
בזאת, אנו מתארים פרוטוקול למדידה בו זמנית שישה חלבונים המצויים ברוק באמצעות מערך נוגדנים מבוסס microsphere סיבים אופטיים. הטכנולוגיה חיסונית המערך מועסק משלבת את היתרונות של ייצור מערך השעיה מבוסס microsphere עם השימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי. כפי שתואר בפרוטוקול הווידאו, זעירים מפולימר 4.5 מיקרומטר זמין מסחרי היו מקודד לשבעה סוגים שונים, הנבדלים בריכוז של שני צבעי ניאון לכודים פיזי בתוך זעירים. Microspheres המקודד המכיל קבוצות carboxyl פני השטח שונו עם נוגדנים חד שבטיים ללכידה דרך הכימיה צימוד EDC / NHS. כדי להרכיב את microarray החלבון, הסוגים השונים של זעירים ממקודדים ופונקציונלית היו מעורבים ושהופקדו באופן אקראי ב4.5 מיקרומטר microwells, שנחרתו כימיים בקצה הפרוקסימלי של צרור סיבים אופטיים. צרור סיבים האופטיים שימש גם כמוביל והדמיה מ 'icrospheres. לאחר הרכבה, microarray שימש כדי ללכוד חלבונים בsupernatant הרוק שנאסף מהמרפאה. זיהוי התבסס על immunoassay כריך באמצעות תערובת של נוגדנים לזיהוי biotinylated לanalytes שונה עם בדיקה ניאון streptavidin מצומדות, R-phycoerythrin. Microarray היה צילם על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשלושה ערוצים שונים, שני לרישום microsphere ואחת לאות assay. Micrographs הקרינה אז היו מפוענח ונותח באמצעות אלגוריתם תוצרת בית בMATLAB.
Introduction
מאז microarray הראשון שדווח על ידי מארק Schena ועמיתים לעבודה באמצע 1990, כלי רב עוצמה זה נוצל בתחומים רבים של מחקר ביולוגי 1. microarrays נוגדנים המסוגל בו זמנית גילוי חלבונים רבים בנוזלי אבחון, כגון דם, יש יישומים חשובים באבחון קליני והקרנת סמן 2-10. רוק, המכיל רבים מאותו analytes כמו דם, כבר נחשב כחלופה עדיפה על דם בגלל אוסף רוק הוא בטוח, לא פולשנית, ויכול להתבצע על ידי אנשי צוות רפואיים מאומנים מינימאלי 11-13. נכון לעכשיו, ניתוח חלבון מרובב באמצעות דגימות רוק הוא מוגבל על ידי מספר גורמים חשובים, כוללים הריכוז הנמוך של חומר אנליטי יעד 14 וטווח הריכוז הרחב של סמנים ביולוגיים שונים 15.
.בזאת, אנחנו מדגימים את הניתוח של שישה חלבונים: גורם אנושי אנדותל כלי דם צמיחה (VEGF), חלבון מושרה אינטרפרון גאמא 10, metallopeptidase מטריצה 9 (MMP-9), ובטא interleukin-1 (IP-10, interleukin-8 (IL-8), גורם הגדילה באפידרמיס) (EGF) (IL-1β) . הביצועים של השיטה בתחילה אומת באמצעות פתרונות סטנדרטיים המהווים חלבוני אנליטי רקומביננטי וחסימת מאגר. דגימות רוק אמיתיות שנאספו מחולים במחלות נשימה כרוניות שונות, כמו גם ביקורת בריאה נבדקו גם עם ביצועים משביעי רצון. הפרוטוקול צריך להיות ישים analytes חלבון אחר ומבוסס מבחני microsphere אחרים. פלטפורמה זו מציעה יתרונות משמעותיים בתחום הכימיה אנליטית כפי שהיא מאפשרת ניתוח סימולטני מהיר, מדויק, ושחזור של ריכוזים נמוכים של כמה חלבונים עם מגוון רחב דינמי, אינטראקציות לא ספציפיים מינימליות, צריכת מדגם מופחתת, ועלות נמוכה בהשוואה ל Assay הצמוד אנזימים מקבילים immunosorbent (ELISA).
Protocol
Representative Results
Discussion
חוקרים צריכים לשים לב במיוחד לשלבים הבאים: לדיוק פענוח טוב יותר, יש צורך לאמת את microspheres הושעו הומוגנית בכל הדגירה ולשטוף צעדים במהלך הליך הקידוד זעירים. בנוסף, זעירים מהמקודדים צריכים להיות מוגן מפני אור לאורך כל הניסוי. לאחר תהליכי קידוד והאחסון נאותים, מצאנו כי דיו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (מענק 08UDE017788-05). EBP גם מכיר תמיכת הקרן הספרדית למדע וטכנולוגיה (FECYT). המחברים מודים שונדה ט גיילורד וPratyusha Mogalisetti לקריאה ביקורתית של כתב היד.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
References
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Schena, M. . Protein Microarray. , (2004).
- Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays. J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).
- Wang, C. C., et al. Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines. J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).
- de Jager, W., Velthuis, t. e., Prakken, H., Kuis, B. J., W, G. T., Rijkers, Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers. Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).
- Vignali, D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).
- Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
- Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis. Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).
- Blicharz, T. M., et al. Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva. Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).
- Mukhopadhyay, R. Devices to drool for. Anal. Chem. 78, 4255-4259 (2006).
- Wong, D. T. Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).
- Segal, A., Wong, D. T. Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better. Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).
- St John, M. A. R., et al. Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).
- Pantano, P., Walt, D. R. Ordered nanowell arrays. Chem. Mater. 8, 2832-2835 (1996).
- Schena, M. . Protein Microarrays. , (2005).
