Une méthode rapide et efficace pour évaluer la pathogénicité d’Ustilago maydis sur les lignées de maïs et de téosinte
Summary
L’utilisation d’une méthode d’injection d’aiguille pour inoculer le maïs et les plantes de teosinte avec l’agent pathogène biotrophic Ustilago maydis est décrite. La méthode d’inoculation par injection d’aiguille facilite l’administration contrôlée de l’agent pathogène fongique entre les feuilles de la plante où l’agent pathogène pénètre dans la plante par la formation d’apprésoria. Cette méthode est très efficace, permettant des inoculations reproductibles avec U. maydis.
Abstract
Le maïs est l’une des principales cultures céréalières dans le monde. Cependant, la sensibilité aux agents pathogènes biotrophiques est le principal obstacle à l’augmentation de la productivité. U. maydis est un champignon pathogène biotrophique et l’agent causal du charbon de maïs sur le maïs. Cette maladie est responsable d’importantes pertes de rendement d’environ 1,0 milliard de dollars par an aux États-Unis1 Plusieurs méthodes, y compris la rotation des cultures, l’application de fongicides et les traitements des semences, sont actuellement utilisées pour contrôler le charbon du maïs2. Cependant, la résistance de l’hôte est la seule méthode pratique pour gérer le charbon de maïs. L’identification des plantes cultivées, y compris le maïs, le blé et le riz, qui sont résistantes à divers agents pathogènes biotrophiques a considérablement réduit les pertes de rendement annuellesde 3à 5 . Par conséquent, l’utilisation d’une méthode d’inoculation d’agents pathogènes qui délivre efficacement et de manière reproductible l’agent pathogène entre les feuilles des plantes faciliterait l’identification rapide des lignées de maïs résistantes à U. maydis. Comme, une première étape vers l’identification des lignées de maïs qui sont résistantes à U. maydis, une méthode d’inoculation par injection d’aiguille et une méthode de criblage de réaction de résistance ont été utilisées pour inoculer des lignées d’introgression de maïs, de téosinte et de maïs x teosinte avec une souche d’U. maydis et pour sélectionner des plantes résistantes.
Des lignées d’introgression de maïs, de téosinte et de maïs x teosinte, composées d’environ 700 plantes, ont été plantées, inoculées avec une souche d’U. maydiset examinées pour la résistance. Les méthodes d’inoculation et de dépistage ont permis d’identifier trois lignées de téosinte résistantes à U. maydis. Ici, un protocole détaillé d’inoculation par injection d’aiguille et de criblage de réaction de résistance pour les lignées d’introgression du maïs, de la téosinte et du maïs x teosinte est présenté. Cette étude démontre que l’inoculation par injection d’aiguilles est un outil précieux en agriculture qui peut fournir efficacement U. maydis entre les feuilles de la plante et a fourni des lignées végétales résistantes à U. maydis qui peuvent maintenant être combinées et testées dans des programmes de sélection pour améliorer la résistance aux maladies.
Introduction
Les maladies fongiques des plantes représentent l’une des menaces les plus éminentes pour l’agriculture. La nécessité de développer des cultures présentant une meilleure résistance aux maladies augmente en raison des besoins alimentaires d’une population mondiale croissante. Les agents pathogènes des plantes infectent naturellement les plantes cultivées dans le champ, provoquant des maladies qui ont un impact négatif sur le rendement des cultures6. Il a été démontré que l’identification et l’utilisation de plantes résistantes peuvent améliorer la résistance et diminuer la perte de rendement. Des cultivars résistants ont été identifiés chez de nombreuses espèces végétales, y compris le maïs, le blé, le riz et le sorgho, en inoculant les plantes avec un phytopathogène et en sélectionnant pour les lignées résistantes7. Par conséquent, la mise au point et l’utilisation d’une méthode d’inoculation efficace permettraient à de nombreuses plantes d’être inoculées et de faire l’objet d’un dépistage de résistance. Diverses méthodes d’inoculation ont été utilisées, y compris l’inoculation par immersion, la canalisation de la culture de suspension cellulaire pathogène dans le tourbillon de la plante et l’inoculation par injection d’aiguille8-11. Avec chaque méthode, l’agent pathogène doit être introduit de manière fiable entre les feuilles de la plante où l’agent pathogène pénètre dans la plante par la formation d’apprésoria pour assurer le développement de l’agent pathogène et l’infection des plantes12,13.
La méthode d’inoculation par immersion consiste à plonger un semis de plante dans une culture en suspension cellulaire d’agent pathogène, tandis que la méthode de pipetage nécessite de placer la culture de suspension cellulaire pathogène dans le tourbillon du semis de plante. Toutefois, il existe des problèmes avec les deux méthodes. Premièrement, les deux méthodes dépendent du mouvement naturel de l’agent pathogène de la surface des feuilles dans le tissu végétal, qui est très variable. La plupart des agents pathogènes pénètrent naturellement dans la plante par des ouvertures stomatiques ou des plaies à la surface des feuilles de la plante. Cependant, il existe une variabilité importante dans la capacité des agents pathogènes à pénétrer à la surface des feuilles de la plante à travers les stomates et/ou les plaies à la surface des feuilles. Par conséquent, la pénétration des agents pathogènes ne peut pas être contrôlée par l’une ou l’autre des méthodes d’inoculation, ce qui pourrait entraîner des données incohérentes. Deuxièmement, lors du criblage d’un grand nombre de plantes, la fusion des semis dans une culture en suspension cellulaire d’agents pathogènes peut prendre beaucoup de temps et peut limiter le nombre de plantes qui peuvent être examinées. A l’inverse, le protocole d’inoculation par injection d’aiguille décrit ici délivre la culture de suspension cellulaire pathogène entre les feuilles de la plante facilitant la formation de l’appressoria14. L’agent pathogène utilise ensuite l’appressoria nouvellement développé pour entrer dans la plante en éliminant le problème de pénétration de l’agent pathogène. De plus, le protocole d’inoculation par injection d’aiguille fournit une gamme de phénotypes pour les plants de maïs et de téosinte qui ont été inoculés avec U. maydis et qui démontrent une bonne infection. Les phénotypes peuvent être utilisés comme marqueur pour déterminer la meilleure concentration pour la culture de suspension cellulaire pathogène, ce qui donne des phénotypes végétaux cohérents dans et entre différentes expériences.
Après l’inoculation des plantes avec une culture en suspension cellulaire pathogène, les plantes sont généralement examinées pour détecter un phénotype8-11,15résistant ou sensible. Bien que les échelles d’évaluation des maladies aient été largement utilisées pour dépister et classer les phénotypes des plantes, les échelles d’évaluation diffèrent selon l’agent pathogène analysé. Par conséquent, un protocole d’évaluation des maladies pour les interactions entre U. maydis et le maïs peut être utilisé pour des agents pathogènes fongiques similaires16.
La présente série de protocoles détaille l’inoculation par injection d’aiguille avec une culture de suspension cellulaire d’U. maydis et un criblage de réaction de résistance aux maladies des lignées d’introgression du maïs, de la téosinte et de la teosinte de maïs x. Les protocoles actuels ne se limitent pas à l’injection à l’aiguille d’U. maydis dans les plants de maïs, mais peuvent être utilisés pour relativement n’importe quel agent pathogène fongique et espèce végétale. Par conséquent, l’inclusion des détails des deux méthodes dans le même protocole permettra aux chercheurs d’utiliser directement les protocoles d’inoculation et de dépistage ou de manipuler les protocoles originaux pour mieux s’adapter à l’agent pathogène et aux espèces végétales d’intérêt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, la méthode d’inoculation par injection à l’aiguille utilisée pour administrer une souche d’U. maydis dans la tige de 700 plants de maïs et de téosinte a été couronnée de succès. De plus, une échelle révisée d’évaluation de la résistance aux maladies a été utilisée pour dépister les plantes et détecter le développement d’agents pathogènes. Grâce à l’utilisation des deux méthodes, des lignées de plantes résistantes à U. maydis ont été identifiée…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions M. Emir Islamovic pour son aide en laboratoire et en serre. Nous remercions également le Dr Sherry Flint-Garcia d’avoir fourni les lignes d’introgression de maïs x teosinte.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Seed for plants | Collected from original crosses | ||
| Growth chamber | Conviron | PGR14 REACH-IN | |
| Planting flats | Hummert International | 14-3385-2 | |
| Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite) | Hummert International | 10-1059-2 | |
| Laminar flow hood | Lab Conoco | 70875372 | |
| Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest | Stocks were grown from original culture | ||
| Sterile loop | Fisher Scientific | S17356A | |
| Potato dextrose agar (PDA) plates | Fisher Scientific | R454311 | |
| Incubator set to 30 °C | Fisher Scientific | 11-690-650F | |
| Sterile toothpicks | Walmart | Purchased from Walmart and sterilized by autoclave | |
| Potato dextrose broth (PDB) | Fisher Scientific | ICN1008617 | |
| Incubator-shaker set to 30 °C | New Brunswick | 14-278-179 | |
| Spectrophotometer | Fisher Scientific | 4001000 | |
| U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml) | Grown from glycerol stock as described in the methods | ||
| 3 ml Syringes | Becton Dickinson | 309606 | |
| .457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles | Kendall Brands | 8881250321 |
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