Um método rápido e eficiente para avaliar a patogenicidade dos maydis ustilago nas linhas de milho e teosinte
Summary
Descreve-se o uso de um método de injeção de agulha para inocular plantas de milho e teosinto com o pato patogênico biotrófico Ustilago maydis. O método de inoculação da injeção de agulha facilita a entrega controlada do patógeno fúngico entre as folhas da planta onde o patógeno entra na planta através da formação de appresoria. Este método é altamente eficiente, permitindo inoculações reprodutíveis com u. maydis.
Abstract
O milho é uma grande cultura de cereais em todo o mundo. No entanto, a suscetibilidade aos pat pato patógenos biotróficos é a principal restrição ao aumento da produtividade. U. maydis é um patógeno fúngico biotrófico e o agente causal do milho smut no milho. Esta doença é responsável por perdas significativas de rendimento de aproximadamente US $ 1,0 bilhão anualmente nos EUA1 Vários métodos, incluindo rotação de culturas, aplicação de fungicida e tratamentos de sementes são atualmente usados para controlar o smut de milho2. No entanto, a resistência do hospedeiro é o único método prático para gerenciar o smut do milho. A identificação de plantas agrícolas, incluindo milho, trigo e arroz resistentes a vários patógenos biotróficos, diminuiu significativamente as perdas de rendimento anualmente3-5. Portanto, o uso de um método de inoculação de patógenos que fornece de forma eficiente e reprodutivelmente o patógeno entre as folhas da planta, facilitaria a identificação rápida de linhas de milho resistentes aos U. maydis. Como, um primeiro passo para a indentificação das linhas de milho resistentes aos U. maydis,um método de inoculação de injeção de agulha e um método de triagem de reação de resistência foi utilizado para inocular as linhas de introgressão de milho, teosinte e milho x teosinto com uma cepa de maydis U. maydis e para selecionar plantas resistentes.
Foram plantadas linhas de introgressão de milho, teosinte e de milho x teosinto, compostas por cerca de 700 plantas, inoculadas com uma cepa de U. maydis,e rastreadas para resistência. Os métodos de inoculação e triagem identificaram com sucesso três linhas de teosinto resistentes aos u. maydis. Aqui é apresentado um protocolo detalhado de inoculação de injeção de agulha e retração de resistência para linhas de introgressão de milho, teosinto e milho x teosinto. Este estudo demonstra que a inoculação de injeção de agulha é uma ferramenta inestimável na agricultura que pode fornecer maydis entre as folhas da planta e forneceu linhas vegetais resistentes aos maydis u. que agora podem ser combinados e testados em programas de reprodução para melhor resistência à doença.
Introduction
As doenças fúngicas das plantas representam uma das ameaças mais eminentes à agricultura. A necessidade de desenvolver culturas com maior resistência à doença está aumentando devido às necessidades alimentares de uma população mundial em crescimento. Patógenos vegetais infectam naturalmente plantas agrícolas no campo causando doenças que impactam negativamente o rendimento da cultura6. Foi demonstrado que identificar e utilizar plantas resistentes pode melhorar a resistência e diminuir a perda de rendimento. Cultivares resistentes foram identificadas em muitas espécies vegetais, incluindo milho, trigo, arroz e sorgo, inoculando as plantas com um patógeno vegetal e selecionando para linhas resistentes7. Portanto, o desenvolvimento e o uso de um método de inoculação eficiente permitiriam que muitas plantas fossem inoculadas e rastreadas para resistência. Vários métodos de inoculação têm sido utilizados, incluindo a inoculação de mergulho, a pipetação da cultura de suspensão celular do patógeno no giro da planta e a inoculação da injeção de agulha8-11. A cada método, o patógeno deve ser introduzido de forma confiável entre as folhas vegetais onde o patógeno entra na planta através da formação de appresoria para garantir o desenvolvimento do patógeno e a infecção vegetal12,13.
O método de inoculação de mergulho envolve submergir uma muda de planta em uma cultura de suspensão de células patógenas, enquanto o método de pipetação requer colocar a cultura de suspensão de células patógenas no turbilhão da muda vegetal. No entanto, há problemas com ambos os métodos. Em primeiro lugar, ambos os métodos dependem do movimento natural do patógeno da superfície da folha para o tecido vegetal, que é altamente variável. A maioria dos patógenos entra naturalmente na planta através de aberturas estomatais ou feridas na superfície da folha vegetal. No entanto, há uma variabilidade significativa na capacidade dos patógenos de penetrar a superfície da folha vegetal através da estomata e/ou feridas na superfície da folha. Portanto, a penetração do patógeno não pode ser controlada com qualquer método de inoculação potencialmente resultando em dados inconsistentes. Em segundo lugar, ao selecionar um grande número de plantas, submergir as mudas em uma cultura de suspensão celular patógena pode ser demorado e pode limitar o número de plantas que podem ser rastreadas. Por outro lado, o protocolo de inoculação de injeção de agulha descrito aqui fornece a cultura de suspensão de células patógenas entre as folhas da planta facilitando a formação de appressoria14. O patógeno então utiliza a appressoria recém-desenvolvida para entrar na planta eliminando o problema de penetração do patógeno. Além disso, o protocolo de inoculação de injeção de agulha fornece uma gama de fenótipos para plantas de milho e teosinto que foram inoculadas com U. maydis e demonstram boa infecção. Os fenótipos podem ser usados como marcador para determinar a melhor concentração para a cultura de suspensão celular patógena, resultando em fenótipos vegetais consistentes dentro e entre diferentes experimentos.
Seguindo a inoculação vegetal com uma cultura de suspensão de células patógenas, as plantas são tipicamente rastreadas para detectar um fenótipo resistente ou suscetível8-11,15. Embora as escalas de classificação da doença tenham sido usadas extensivamente para triagem e classificação de fenótipos vegetais, as escalas de classificação diferem dependendo do patógeno que está sendo analisado. Portanto, um estabelecimento de protocolo de escala de classificação de doenças para as interações de u. maydis e milho pode ser utilizado para patógenos fúngicos semelhantes16.
A presente série de protocolos detalha a inoculação da injeção de agulha com uma cultura de suspensão celular dos EUA e triagem de reação de resistência à doença de linhas de introgressão de milho, teosinte e milho x teosinto. Os protocolos atuais não se limitam à inoculação de injeção de agulha de U. maydis em plantas de milho, mas podem ser utilizados para relativamente qualquer patógeno fúngico e espécies vegetais. Portanto, incluir os detalhes de ambos os métodos no mesmo protocolo permitirá que os pesquisadores utilizem diretamente os protocolos de inoculação e triagem ou manipulem os protocolos originais para melhor se adequarem ao patógeno e às espécies de interesse vegetal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, o método de inoculação de injeção de agulha usado para fornecer uma cepa de U. maydis na haste de 700 plantas de milho e teosinto foi bem sucedido. Além disso, uma escala revisada de classificação de resistência à doença foi usada para rastrear as plantas e detectar o desenvolvimento de patógenos. Como resultado do uso de ambos os métodos, foram identificadas linhas vegetais resistentes aos maydis u. foram identificadas entre 700 plantas de milho e teosinto que agora podem ser…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Emir Islamovic pela assistência laboratorial e de estufa. Também agradecemos ao Dr. Sherry Flint-Garcia por fornecer as linhas de introgressão de milho x teosinte.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Seed for plants | Collected from original crosses | ||
| Growth chamber | Conviron | PGR14 REACH-IN | |
| Planting flats | Hummert International | 14-3385-2 | |
| Soil (3 parts pine bark; 1 part peat moss with perlite) | Hummert International | 10-1059-2 | |
| Laminar flow hood | Lab Conoco | 70875372 | |
| Glycerol stock of pathogen (U. maydis) or fungal pathogen of interest | Stocks were grown from original culture | ||
| Sterile loop | Fisher Scientific | S17356A | |
| Potato dextrose agar (PDA) plates | Fisher Scientific | R454311 | |
| Incubator set to 30 °C | Fisher Scientific | 11-690-650F | |
| Sterile toothpicks | Walmart | Purchased from Walmart and sterilized by autoclave | |
| Potato dextrose broth (PDB) | Fisher Scientific | ICN1008617 | |
| Incubator-shaker set to 30 °C | New Brunswick | 14-278-179 | |
| Spectrophotometer | Fisher Scientific | 4001000 | |
| U. maydis cell suspension culture (1 x 106 cells/ml) | Grown from glycerol stock as described in the methods | ||
| 3 ml Syringes | Becton Dickinson | 309606 | |
| .457 mm x 1.3 cm Hypodermic needles | Kendall Brands | 8881250321 |
References
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