Issu l'évolution temporelle du glutamate Dégagement avec une analyse de déconvolution des courants de Transporteur ASTROCYTIQUES
Summary
Nous décrivons une méthode analytique pour estimer la durée de vie de glutamate au niveau des membranes astrocytes à partir d'enregistrements électrophysiologiques des courants de transporteur du glutamate dans les astrocytes.
Abstract
La plus forte densité de transporteurs du glutamate dans le cerveau se trouve dans les astrocytes. Le glutamate en couple de transporteurs le mouvement du glutamate à travers la membrane avec le co-transport de Na + et 3 1 H + et le contre-transport de K + 1. Le courant stoechiométrique généré par le processus de transport peut être contrôlée au moyen d'enregistrements de patch-clamp de cellules entières provenant astrocytes. L'évolution dans le temps du courant enregistré est façonné par l'évolution temporelle du profil de concentration de glutamate qui astrocytes sont exposées, la cinétique de transporteurs du glutamate, et les propriétés des membranes passives électrotoniques astrocytiques. Nous décrivons ici les méthodes expérimentales et analytiques qui peuvent être utilisés pour enregistrer les courants de transporteur du glutamate dans les astrocytes et isoler le cours du temps de jeu glutamate de tous les autres facteurs qui façonnent la forme d'onde des courants de transporteurs astrocytaires. Les méthodes décrites ici peuvent être utilisées pour estimer la durée de vie of flash-Uncaged et synaptiquement-glutamate libéré à membranes astrocytaires dans n'importe quelle région du système nerveux central pendant la santé et la maladie.
Introduction
Les astrocytes sont l'un des types cellulaires les plus abondants dans le cerveau avec une morphologie en forme d'étoile et des protubérances membranaires fines qui s'étendent tout au long de la neuropile et atteignent voisins contacts synaptiques 1,2. La membrane de la cellule Les astrocytes de forte densité est emballé avec des molécules d'transporteur du glutamate 3. Dans les conditions physiologiques, transporteurs du glutamate se lient rapidement glutamate sur le côté extracellulaire de la membrane et le transférer dans le cytoplasme de la cellule. Ce faisant, les transporteurs maintiennent bas la concentration basale de glutamate dans l'espace extracellulaire 4. Transporteurs du glutamate dans les processus astrocytaires fins adjacents à excitateurs synapses sont idéalement positionnés pour lier glutamate libéré lors d'événements synaptiques comme il diffuse loin de la fente synaptique. Ce faisant, les transporteurs limitent également les retombées glutamate vers et péri-régions extra-synaptiques et sur synapses voisines, ce qui réduit la dispersion spatiale du signal d'excitations dans le cerveau de 5 à 7.
Transport du glutamate est un processus électrogénique stoechiométrique couplé au mouvement de 3 Na + et H + 1 le long de leur gradient électrochimique et à la contre-transport de K + 1 8. Transport du glutamate est associée (mais pas stœchiométriquement couplé à) une conductance anionique perméable à la SCN – (thiocyanate)> NO 3 – (nitrate) ≈ ClO 4 – (perchlorate)> I -> Br -> Cl -> F -, pas de CH 3 SO 3 – (méthane sulfonate) et C 6 H 11 O 7 – (gluconate) 9-11. Les deux courants (stoechiométrique ou non stoechiométrique) peuvent être enregistrées par l'obtention d'enregistrements de patch-clamp de cellules entières de astrocytes, identifiés visuellement sous un éclairage Dodt ou infra-rouge contraste d'interférence différentiel (IR-DIC) dans acute tranches de cerveau 12. La composante stoechiométrique du courant associé au transport du glutamate à travers la membrane peut être isolé en utilisant CH 3 SO 3 -, ou 11 C 6 H o 7 – solutions intracellulaires base et peut être provoquée par le glutamate flash-uncaging sur les astrocytes 13,14, ou en activant la libération de glutamate à partir de synapses voisines, soit électriquement ou 12 avec une commande de optogenetic ciblée.
L'évolution temporelle de la composante stoechiométrique du courant transporteur est façonnée par la vie du profil de concentration du glutamate au niveau des membranes astrocytaires (c.-garde au glutamate), la cinétique de transporteurs du glutamate, les propriétés des membranes passives des astrocytes, et au cours de stimulations synaptiques, par le synchronicité de la libération de glutamate dans les synapses activées 13. Nous décrivons ici en détail: (1) une appr expérimentaleOach d'isoler la composante stoechiométrique des courants de transporteur du glutamate à partir d'enregistrements de patch-clamp de cellules entières de astrocytes en utilisant la souris coupes d'hippocampe aigus comme exemple la préparation expérimentale, (2) une approche analytique pour dériver le cours du temps de jeu glutamate à partir de ces enregistrements 13, 14. Ces méthodes peuvent être utilisées pour enregistrer et analyser les courants de transporteur du glutamate de astrocytes dans n'importe quelle région du système nerveux central.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici une approche expérimentale pour obtenir des enregistrements électrophysiologiques des astrocytes, un protocole d'analyse pour isoler les courants de transporteur du glutamate dans les astrocytes et une méthode mathématique pour calculer le cours du temps de jeu glutamate à partir des courants de transporteurs astrocytaires.
Le succès de l'analyse repose sur la capacité à obtenir des enregistrements de patch clamp haute qualité à partir des astrocytes et …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par l'Institut national des troubles neurologiques et du programme de recherche intra-muros Course (NS002986). AS a écrit le manuscrit et mis en œuvre l'analyse de déconvolution. JSD développé la version initiale de l'analyse de déconvolution et commenté le texte.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| CGP52432 | Tocris | 1246 | |
| (R,S)-CPP | Tocris | 173 | |
| DPCPX | Tocris | 439 | |
| LY341495 disodium salt | Tocris | 4062 | |
| MSOP | Tocris | 803 | |
| NBQX disodium salt | Tocris | 1044 | |
| D,L-TBOA | Tocis | 1223 | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| MNI-L-glutamate | Tocris | 1490 | |
| Alexa 594 | Life Technologies | A10438 | Optional |
| Matrix electrodes | Frederick Haer Company | MX21AES(JD3) | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
| Dual-stage glass micro-pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Loctite 404 instant adhesive | Ted Pella | 46551 | |
| Xe lamp | Rapp OptoElectronic | FlashMic | |
| Igor Pro 6 | Wavemetrics |
References
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