Выводя на динамику Глутамат зазор Деконволюция Анализ астроцитов Токи Transporter
Summary
Опишем аналитический метод оценки срока службы глутамата астроцитов в мембранах из электрофизиологических записей глутамата токи транспортера в астроциты.
Abstract
Высокая плотность транспортеры глутамата в мозге находится в астроциты. Глутамат пару транспортеры движение глутамата через мембрану при содействии транспортировки 3 Na + и 1 H + и противоположно направленного транспорта 1 К +. Стехиометрического ток, генерируемый транспортного процесса можно контролировать с цельноклеточная патч-зажим записи из астроцитов. Временной ход записан текущий формируется временной ход глутамата профиль концентрации в котором астроциты подвергаются, кинетика глутамата транспортеры, и пассивный электротоническим свойства астроцитов мембран. Здесь мы описываем экспериментальных и аналитических методов, которые могут быть использованы для записи глутамата токи транспортера в астроцитах и изолировать временной ход глутамата зазор от всех других факторов, которые определяют форму волны тока астроцитов транспортер. Методы, описанные здесь, могут быть использованы для оценки времени жизни оF-вспышкой и Uncaged синаптически выпустили глутамата на мембранах астроцитов в любом регионе центральной нервной системы во время здоровья и болезни.
Introduction
Астроциты являются одним из наиболее распространенных типов клеток в мозге со звездообразной морфологии и мелкие выступы мембраны, которая распространяется на всю нейропилей и достичь 1,2 соседних синаптических контактов. Клеточной мембраны астроцитов 'плотно заполнена молекулы глутамата Перевозчик 3. В физиологических условиях глутамата транспортеры быстро связывать глутамат на внеклеточный стороне мембраны и передавать ее в цитоплазме клетки. Поступая таким образом, транспортеры поддерживать низкие базальные концентрации глутамата во внеклеточном пространстве 4. Глутамат транспортеры в хорошую астроцитов процессов, прилегающих к возбуждающих синапсов идеально расположены для связывания глутамата выделяется при синаптических событий, как это диффундирует из синаптической щели. Поступая таким образом, транспортеры глутамата также ограничить побочные к пери-и экстра-синаптических регионах и на соседние синапсы, уменьшая пространственное распространение возбуждающего сигналасек в мозге 5-7.
Глутамат транспорт электрогенных процесс стехиометрически сочетании с движением 3 Na + и 1 H + вдоль их электрохимического градиента и противоположно направленного транспорта 1 К + 8. Глутамат транспорта связан с (но не стехиометрическом соединены с) анионные проводимости проницаемой для SCN – (тиоцианатом)> NO 3 – (нитрат) ≈ ClO 4 – (перхлораты)> I -> Br -> Cl -> F -, а не СН 3 SO 3 – (метансульфоната) и C 6 H 11 O 7 – (глюконат) 9-11. Оба токов (стехиометрические и нестехиометрическое) могут быть записаны путем получения цельноклеточная патч-зажим записи из астроцитов, визуально, выявленных в рамках Dodt освещения или инфракрасных дифференциального интерференционного контраста (IR-DIC) в acutэлектронной срезах мозга 12. Стехиометрического составляющей тока, связанных с глутаматом транспорт через мембрану может быть выделен с помощью CH 3 SO 3 – или С 6 Н 11 О 7 – на основе внутриклеточных растворов и может быть вызвано с помощью флэш-uncaging глутамата на астроциты 13,14, или путем активации высвобождение глутамата из соседних синапсов, либо электрическим, 12 или с целевой контроль optogenetic.
Временной ход стехиометрического компонент транспортер ток имеет форму временем жизни глутамата профиль концентрации при астроцитов мембраны (например, глутамат зазор), кинетика глутамата транспортеры, пассивный свойства мембраны астроцитов, а в синаптической стимуляции, к синхронность высвобождение глутамата через активированный синапсы 13. Здесь мы опишем во всех деталях: (1) экспериментальная провертренере, чтобы изолировать стехиометрического компонентом глутамат токов транспортер с цельноклеточной патч-зажим записи из астроцитов использованием острого мышь срезах гиппокампа в качестве примера экспериментального препарата, (2) аналитический метод для получения временной ход глутамата очистка от этих записей 13, 14. Эти методы могут быть использованы для записи и анализа глутамата токов транспортер из астроцитов в любой области центральной нервной системы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы опишем экспериментальный подход, чтобы получить электрофизиологических записей из астроцитов, аналитический протокол для изоляции глутамата токи транспортера в астроцитах и математические методы для получения временной ход глутамата зазор от астроцитов токов транспор?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке Национального института неврологических расстройств и инсульта Внутренние программы исследований (NS002986). Как писал рукопись и реализованы деконволюцией анализа. JSD разработал первоначальный вариант деконволюцией анализа и прокомментировал текст.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| CGP52432 | Tocris | 1246 | |
| (R,S)-CPP | Tocris | 173 | |
| DPCPX | Tocris | 439 | |
| LY341495 disodium salt | Tocris | 4062 | |
| MSOP | Tocris | 803 | |
| NBQX disodium salt | Tocris | 1044 | |
| D,L-TBOA | Tocis | 1223 | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| MNI-L-glutamate | Tocris | 1490 | |
| Alexa 594 | Life Technologies | A10438 | Optional |
| Matrix electrodes | Frederick Haer Company | MX21AES(JD3) | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
| Dual-stage glass micro-pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Loctite 404 instant adhesive | Ted Pella | 46551 | |
| Xe lamp | Rapp OptoElectronic | FlashMic | |
| Igor Pro 6 | Wavemetrics |
References
- Ventura, R., Harris, K. M. Three-dimensional relationships between hippocampal synapses and astrocytes. J. Neurosci. 19, 6897-6906 (1999).
- Witcher, M. R., Kirov, S. A., Harris, K. M. Plasticity of perisynaptic astroglia during synaptogenesis in the mature rat hippocampus. Glia. 55, 13-23 (2007).
- Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Prog. Neurobiol. 65, 1-105 (2001).
- Herman, M. A., Jahr, C. E. Extracellular glutamate concentration in hippocampal slice. J. Neurosci. 27, 9736-9741 (2007).
- Arnth-Jensen, N., Jabaudon, D., Scanziani, M. Cooperation between independent hippocampal synapses is controlled by glutamate uptake. Nat. Neurosci. 5, 325-331 (2002).
- Barbour, B. An evaluation of synapse independence. J. Neurosci. 21, 7969-7984 (2001).
- Rusakov, D. A., Kullmann, D. M. Extrasynaptic glutamate diffusion in the hippocampus: ultrastructural constraints, uptake, and receptor activation. J. Neurosci. 18, 3158-3170 (1998).
- Zerangue, N., Kavanaugh, M. P. Flux coupling in a neuronal glutamate transporter. Nature. 383, 634-637 (1038).
- Eliasof, S., Jahr, C. E. Retinal glial cell glutamate transporter is coupled to an anionic conductance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 4153-4158 (1996).
- Wadiche, J. I., Amara, S. G., Kavanaugh, M. P. Ion fluxes associated with excitatory amino acid transport. Neuron. 15, 721-728 (1995).
- Wadiche, J. I., Kavanaugh, M. P. Macroscopic and microscopic properties of a cloned glutamate transporter/chloride channel. J. Neurosci. 18, 7650-7661 (1998).
- Bergles, D. E., Jahr, C. E. Synaptic activation of glutamate transporters in hippocampal astrocytes. Neuron. 19, 1297-1308 (1997).
- Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J. Neurosci. 25, 2906-2916 (2005).
- Scimemi, A., Tian, H. Neuronal transporters regulate glutamate clearance, NMDA receptor activation, and synaptic plasticity in the hippocampus. J. Neurosci. 29, 14581-14595 (2009).
- Zuo, Z. Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells. Neuroreport. 12, 1077-1080 (2001).
- Barbour, B., Brew, H., Attwell, D. Electrogenic uptake of glutamate and aspartate into glial cells isolated from the salamander (Ambystoma) retina. J. Physiol. 436, 169-193 (1991).
- Bergles, D. E., Tzingounis, A. V., Jahr, C. E. Comparison of coupled and uncoupled currents during glutamate uptake by GLT-1 transporters. J. Neurosci. 22, 10153-10162 (2002).
- Diamond, J. S., Jahr, C. E. Synaptically released glutamate does not overwhelm transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation. J. Neurophysiol. 83, 2835-2843 (2000).
- Benediktsson, A. M., et al. Neuronal activity regulates glutamate transporter dynamics in developing astrocytes. Glia. 60, 175-188 (2012).
- Hires, S. A., Zhu, Y., Tsien, R. Y. Optical measurement of synaptic glutamate spillover and reuptake by linker optimized glutamate-sensitive fluorescent reporters. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4411-4416 (2008).
- Scimemi, A., Meabon, J., Woltjer, R. L., Sullivan, J. M., Diamond, J. S., Cook, D. G. Amyloidβ1-42 slows clearance of synaptically-released glutamate by mislocalizing astrocytic GLT-1. J. Neurosci. 33, 5312-5318 (2013).
