Die Ableitung der zeitliche Verlauf der Glutamate Ausverkauf mit Dekonvolutionsanalyse von Astrozytäre Transporter Currents
Summary
Wir beschreiben eine analytische Methode, um die Lebensdauer von Glutamat an astrozytären Membranen schätzen von elektrophysiologischen Ableitungen von Glutamat-Transporter Ströme in Astrozyten.
Abstract
Die höchste Dichte von Glutamat-Transporter im Gehirn in Astrozyten gefunden. Glutamattransporter Paar die Bewegung von Glutamat durch die Membran mit dem Co-Transport von 3 Na + und H + 1 und der Gegenelektrode Transport von 1 K +. Das stöchiometrische Strom, der durch den Transport Prozess erzeugt wird, kann mit whole-cell Patch-Clamp-Aufnahmen von Astrozyten überwacht werden. Der zeitliche Verlauf der aufgezeichneten Strom wird durch den zeitlichen Verlauf der Glutamatkonzentration Profil auf die Astrozyten ausgesetzt sind, die Kinetik der Glutamat-Transporter, und die passive elektrotonischen Eigenschaften von Astrozyten Membranen geformt. Hier beschreiben wir die experimentellen und analytischen Methoden, die verwendet werden, um Glutamattransporter Ströme in Astrozyten erfassen und isolieren den zeitlichen Verlauf der Glutamat-Clearance von allen anderen Faktoren, die die Wellenform der Astrozyten-Transporter Ströme formen kann. Die hier beschriebenen Methoden können verwendet werden, um die Lebensdauer o abzuschätzenf Flash-uncaged und Glutamat in Astrozyten Membranen in jeder Region des zentralen Nervensystems bei Gesundheit und Krankheit synaptisch-released.
Introduction
Astrozyten sind eine der am häufigsten vorkommenden Zelltypen im Gehirn mit sternförmigen Morphologie und feine Membran Vorsprünge, die in der gesamten Neuropils erweitern und erreichen benachbarten synaptische Kontakte 1,2. Die Astrozyten 'Zellmembran ist dicht mit Glutamat-Transporter-Moleküle 3 verpackt. Unter physiologischen Bedingungen Glutamattransporter schnell binden Glutamat an der extrazellulären Seite der Membran und überträgt es auf Zytoplasma der Zelle. Auf diese Weise erhalten die Transporter günstig die basale Konzentration von Glutamat in den extrazellulären Raum 4. Glutamat-Transporter in feine Astrozytenfortsätze benachbarten Synapsen erregenden sind ideal positioniert, um Glutamat während der synaptischen Ereignisse veröffentlicht, sobald sie weg aus dem synaptischen Spalt diffundiert binden. Damit die Transporter auch begrenzen Glutamat Spillover auf peri-und extra-synaptischen Regionen und auf benachbarten Synapsen, die Verringerung der räumlichen Ausbreitung der erregenden Signals im Gehirn 5-7.
Glutamate Transport ist ein Prozess elektrogenen stöchiometrisch auf die Bewegung von 3 gekoppelt Na + und H + 1 entlang ihrer elektrochemischen Gradienten und dem Zähler-Transport von 1 K + 8. (Thiocyanat)> NO – 3 – (Nitrat) ≈ ClO 4 – (Perchlorat)> I -> Br -> Cl -> F -, nicht Glutamate Transport mit (aber nicht stöchiometrisch gekoppelt) ein anionisches Leitwert durchlässig SCN verbunden um CH 3 SO 3 – (Methansulfonat) und C 6 H 11 O 7 – (Gluconat) 9-11. Beide Ströme (stöchiometrischen und nicht-stöchiometrischen) durch Erhalten Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen von Astrozyten, visuell unter Dodt Beleuchtungs-oder Infrarot-Differential-Interferenz-Kontrast (IR-DIC) in acut identifiziert aufgezeichnet werdene Gehirnscheiben 12. Das stöchiometrische Komponente des Stroms mit Glutamat Transport über die Membran verbunden sind, können durch Verwendung von CH 3 SO 3 isoliert werden – oder C 6 H 11 O 7 – basierten intrazellulären Lösungen und kann durch Flash-Uncaging Glutamat auf Astrozyten 13,14 hervorgerufen werden, oder durch die Aktivierung Glutamat-Freisetzung aus benachbarten Synapsen, entweder elektrisch 12 oder mit einer gezielten optogenetische Kontrolle.
Der zeitliche Verlauf der stöchiometrischen Komponente des Transporters Strom durch die Lebensdauer des Glutamat-Konzentration in Astrozyten Profil Membranen (zB Glutamat Clearance) geformt, die Kinetik der Glutamat-Transporter, die passive Membran Eigenschaften von Astrozyten und während der synaptischen Reize, durch die Synchronität der Freisetzung von Glutamat in den aktivierten Synapsen 13. Hier beschreiben wir ausführlich: (1) eine experimentelle ca.oach die stöchiometrische Komponente von Glutamat-Transporter Ströme von whole-cell Patch-Clamp-Aufnahmen von Astrozyten mit akuten Maus Hippocampus als Beispiel experimentelle Vorbereitung isolieren, (2) ein analytischer Ansatz zur Ableitung des zeitlichen Verlaufs von Glutamat-Clearance von diesen Aufnahmen 13, 14. Diese Methoden können verwendet werden, um aufzuzeichnen und zu analysieren Glutamattransporter Ströme von Astrozyten in einer beliebigen Region des zentralen Nervensystems werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier haben wir einen experimentellen Ansatz zur elektrophysiologischen Ableitungen von Astrozyten erhalten beschreiben, leiten ein analytisches Protokoll Glutamattransporter Ströme in Astrozyten isolieren und eine mathematische Methode, um den zeitlichen Verlauf der Glutamat-Clearance von Astrozyten-Transporter Ströme.
Der Erfolg der Analyse beruht auf der Fähigkeit, hochwertige Patch-Clamp-Aufnahmen von Astrozyten zu erhalten und auf die Genauigkeit der Anpassungsalgorithmen verwendet, u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das National Institute of Neurological Disorders and Stroke Interne Research Program (NS002986) unterstützt. AS schrieb das Manuskript und umgesetzt Dekonvolutionsanalyse. JSD entwickelte die erste Version des Dekonvolutionsanalyse und kommentiert den Text.
Materials
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| CGP52432 | Tocris | 1246 | |
| (R,S)-CPP | Tocris | 173 | |
| DPCPX | Tocris | 439 | |
| LY341495 disodium salt | Tocris | 4062 | |
| MSOP | Tocris | 803 | |
| NBQX disodium salt | Tocris | 1044 | |
| D,L-TBOA | Tocis | 1223 | |
| Picrotoxin | Sigma | P1675 | |
| MNI-L-glutamate | Tocris | 1490 | |
| Alexa 594 | Life Technologies | A10438 | Optional |
| Matrix electrodes | Frederick Haer Company | MX21AES(JD3) | |
| Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
| Dual-stage glass micro-pipette puller | Narishige | PC-10 | |
| Loctite 404 instant adhesive | Ted Pella | 46551 | |
| Xe lamp | Rapp OptoElectronic | FlashMic | |
| Igor Pro 6 | Wavemetrics |
References
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