כימות תגובת Burst נשימה כאינדיקטור של החיסון מולדת בריאות בדג הזברה
Summary
התגובה החיסונית המולדת מגנה על אורגניזמים מפני זיהום הפתוגן. מרכיב קריטי של התגובה החיסונית המולדת, פרץ הנשימה תא בלען, מייצר מיני חמצן תגובתי שהורגים מיקרואורגניזמים פולשים. אנו מתארים assay פרץ נשימה שמכמת מיני חמצן תגובתי נוצרו כאשר התגובה החיסונית המולדת מושרה כימית.
Abstract
פרץ הנשימה תא בלען הוא חלק מהתגובה החיסונית המולדת לזיהום הפתוגן וכרוך בייצור של מיני חמצן תגובתי (ROS). ROS הם רעילים ולתפקד כדי להרוג מיקרואורגניזמים phagocytized. בvivo כימות של ROS נגזר תא בלען מספקת מידע לגבי היכולת של האורגניזם לעלות תגובה חיסונית מולדת חזקה. כאן אנו מתארים פרוטוקול לכמת ולהשוות ROS בעוברי דג הזברה שלמים על אינדוקציה כימית של פרץ הנשימה תא בלען. שיטה זו עושה שימוש במתחם שאינו ניאון שהופך ניאון על ידי חמצון ROS. עוברי דג הזברה אישיות pipetted לתוך הבארות של microplate וטופחו בfluorogenic מצע זה עם או בלי inducer כימי של הפרץ בדרכי הנשימה. הקרינה בכל אחד גם היא לכמת בנקודות זמן רצויות באמצעות קורא microplate. קריאות הקרינה מותאמות לחסל את הקרינה רקע ולאחר מכן במשותףmpared באמצעות מבחן t מזווג. שיטה זו מאפשרת השוואה של פוטנציאל פרץ הנשימה של עוברי דג הזברה בשלבי התפתחות שונים ובתגובה למניפולציות ניסיוני, כגון מציאה חלבון, ביטוי יתר, או טיפול עם סוכנים תרופתיים. גם בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לפקח על תגובת פרץ בדרכי הנשימה בכליות שלמות גזורות או תכשירי תא מכליות של דג הזברה מבוגר וכמה מיני דגים אחרים. אנו מאמינים כי הפשטות והתאמה היחסית של פרוטוקול זה ישלימו את הפרוטוקולים קיימים ויהיו עניין לחוקרים המבקשים להבין את התגובה החיסונית המולדת טוב יותר.
Introduction
מערכת החיסון מורכבת משני סניפים: חסינות מולדת ובעלי כושר הסתגלות. החסינות מולדת היא אבולוציונית עתיקה יותר חסינות אדפטיבית. חסרי חוליות נמצאות כיום חשבו שיש רק חסינות מולדת, בעוד שבעלי חוליות יש שני הסניפים המולדים ובעלי כושר הסתגלות. בעוד חסינות אדפטיבית מקנה חסינות ספציפית וארוכת טווח לפתוגנים מסוימים, חסינות מולדת היא תגובה מיידית לחיידקים פולשים, וירוסים ופטריות. היבט חיוני של תגובת החיסון המולדת כולל את שחרורו של ציטוקינים וכמוקינים, שגורם לדלקת וגיוס phagocytes (למשל מקרופאגים, נויטרופילים) לבלוע ולהשמיד פולשים זרים.
תגובות חיסוניים מולדים מוצלחות לערב: (1) הכרה במיקרואורגניזמים פולשים, (2) אינדוקציה של המפלים המתאימים איתות (למשל שחרורו של ציטוקינים וכמוקינים); (3) התפתחות תקינה / מספרים מספקים של תאי phagocytic; (4) הגירה של phagocytes לאתרים של זיהום; (5) היבלעות של פתוגנים, וכן (6) השמדת מיקרואורגניזמים נבלעו. מחסור בכל אחד מהשלבים הבאים עלול להוביל למארח להיות המום, ונכנע ל, הזיהום. תגובה חיסונית מולדת חזקה היא חיונית לבריאותם של אורגניזמים כי זה קו הגנה הראשון מפני פתוגנים בכל הצמחים ובעלי החיים. בבעלי חוליות, זה גם מגביר את התגובה החיסונית אדפטיבית 1. לכן, זה קריטי, כי אנחנו מסוגלים להעריך את כל ההיבטים של תגובת החיסון המולדת כדי להבין את זה טוב יותר ועל מנת לייעל את תפקודו.
אורגניזמים מודל רבים משמשים ללמוד חסינות מולדת, החל Arabadopsis לג elegans לדרוזופילה לעכברים לתאי אדם בתרבית. יתרון בשימוש במערכת מודל (Danio rerio) דג הזברה ללמוד חסינות מולדת הוא שדג הזברה היא חוליות, עם im שני המולדות אדפטיביתmunity, אך הפיתוח של חסינות מולדת ובעלי כושר הסתגלות מופרד בזמן. דג הזברה להסתמך רק על חסינות מולדת להגנה מפני זיהום עד חסינות אדפטיבית הופכת מתפקד במלואה, אשר מתרחשת לאחר סביב 4-6 שבועות הפריה 2. בנוסף לכלים למניפולציה גנטית, בהירות אופטית והתפתחות מהירה, חיצונית, חסינות מולדת כמצב עיקרון ההגנה בעוברי דג הזברה מספקת מודל מופשט שבו ללמוד את המורכבות של תגובת החיסון המולדת in vivo.
פרוטוקולים מרובים פותחו כדי להעריך את ההיבטים שונים של התגובה החיסונית המולדת בעוברי דג הזברה. Microarrays וRNAseq אימתו כי פרופילי ציטוקינים שהושרו על ידי התגובה החיסונית המולדת דג הזברה הם דומים לזו של בני אדם וגם הציעו את מעורבותם של גנים בלתי צפויים בחסינות מולדת 3,4. השקיפות של עובר דג הזברה וניאון, transgenזני ic של פתוגנים ודג זברה מאפשרים ויזואליזציה של אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן דינמיים in vivo בזמן אמת. עוברי דג הזברה מהונדסים להביע GFP תחת שליטה של אמרגן נויטרופילים הספציפיים myeloperoxidase 5,6 או אמרגן MPEG1 מקרופאג ספציפי 7 הפכו אותו ניתן לחזות ולכמת הגירת תא בלען לאתרים של זיהומים מקומיים 8, כמו גם כדי להמחיש phagocytosis והרס של כותרתו fluorescently פתוגנים 8,9. עוברי דג הזברה גם נתונים לדור של מבחני תפוקה גבוהה והמסכים כימיים. בהתאם לכך, שיטות תפוקה גבוהה של ניתוח transcriptome על זיהום 10 והגירה תא בלען לאתרים של פגיעה כימית שגרמה 11 לאחרונה פותחו.
של הטכניקות המפורטות לעיל, אף כמותית להעריך את השלב הסופי של השמדת הפתוגן ידי phagocytes. שלב סופי זהכרוך בפרץ בדרכי הנשימה (כלומר ייצור של ROS ותרכובות רעילות אחרות), אשר להרוג פתוגנים נבלעו. מונואמין NADPH האנזים הוא מקור עיקרי של ROS בתאי phagocytic. הרכבה של יחידות משנה של תוצאות אנזים מונואמין NADPH בהעברת אלקטרונים לחמצן, שהניבו אניוני סופראוקסיד. דרך תגובות אנזימטיות שלאחר מכן, סופראוקסיד אז יכול להיות מומר למי חמצן וחומצת hypochlorous (איור 1 א). זה פרץ הנשימה של phagocytes שהורג פתוגנים וכך, כימות של פוטנציאל פרץ הנשימה של עוברי דג הזברה היא מעיד על בריאות מערכת החיסון מולדת בכללותה. פיתחנו assay הקרינה מבוסס לכמת את פרץ הנשימה בקבוצות של עוברי דג הזברה בודדים 12. assay זה מנצל בצורה לא פלורסנט, מופחתת של צבע זמין באופן מסחרי, תא חדיר. צבע זה, 2 ', diacetate 7'-dichlorodihydrofluorescein (H2DCFDA), מומר לנורותמתחם הסנט, 2 ', 7'-dichlorofluorescein (DCF), על חמצון. ROS המגוון שנוצר על ידי פרץ הנשימה תא בלען יכול לחמצן H2DCFDA וליצור הקרינה 24. המראה של הקרינה יכול לשמש כדי לכמת ולהשוות את תגובת פרץ בדרכי הנשימה בין קבוצות של דג הזברה. אצטט החלבון קינאז C Myristate phorbol אגוניסט (PMA) משמש כדי לגרום כימי מונואמין NADPH כדי לייצר ROS ובכך להגדיל את קריאות הקרינה (איור 1). בזאת, אנו מספקים פרוטוקול מפורט של גרסה שונה והמותאמת של assay זה דג הזברה עובר הנשימה פרץ. assay זה יכול לשמש כדי להשוות את פרץ הנשימה בין קבוצות של עוברי דג הזברה בודדים לאורך זמן ו / או בתגובה למניפולציות ניסיוני (מציאה חלבון למשל בתיווך morpholino). השימוש בשיטה זו, בשילוב עם מבחני חסינות אחרים דג הזברה מולדים, תספק תמונה של מורכב וקריטי שלמה יותרתגובה חיסונית מולדת.
Protocol
Representative Results
Discussion
התפקיד העיקרי של phagocytes הוא לזהות, לבלוע ולהשמיד פתוגנים. היכולת של phagocytes לייצר פרץ נשימה נאות היא קריטית עבור פונקציה זו. לפיכך, כימות של תגובת פרץ בדרכי הנשימה היא שיטה אחת כדי לאפשר השוואה של בריאות כללית מולדת חיסונית ותפקוד בין קבוצות של יחידים ו / או בתגובה למניפו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להכיר חברים בעבר ובהווה של המעבדה קים, מארק Nilan לטיפול בדג זברה ותחזוקה, ד"ר רוברט וילר לדיונים מועילים ושיתוף נתונים, ומענקי NIH 3RO1GM087308-02S1 ו1P20RR024475-01A2 וחקלאות מיין והיער להתנסות תחנה (מספר פרסום 3303) למימון.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| H2DCFDA | Sigma Aldrich | 35845-1G | |
| PMA | Fisher | BP6851 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-5X10ML | |
| Tricaine S MS222 | Western Chemical | 100 grams | |
| DMEM/F-12, No Phenol Red | Life Technologies | 11039-021 | |
| Deep Petri Dishes | VWR | 89107-632 | |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| #5 Dumont Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| 1.7 ml Micro Centrifuge Tubes | Axygen | 10011-724 | |
| 15 ml Conical Centrifuge Tubes | VWR | 21008-918 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | Contact BioTek | |
| Black 96 Well Microplate | VWR | 82050-728 | |
| 25 ml Sterile Reservoirs | VistaLab | 3054-2003 | |
| P200 Pipettor | Gilson | F123601 | |
| Multichannel Pipettor | VWR | 89079-948 | |
| Pipette Tips | VWR | 89079-478 |
References
- Medzhitov, R., Janeway, C. A. Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response. Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).
- Lam, S. H., Chua, H. L., et al. Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling. In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).
- Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., et al. Transcriptome Profiling and Functional Analyses of the Zebrafish Embryonic Innate Immune Response to Salmonella Infection. J Immunol. 9. 9, 5641-5653 (2009).
- Ordas, A., Hegedus, Z., et al. Deep Sequencing of the Innate Immune Transcriptomic Response of Zebrafish Embryos to Salmonella Infection. Fish & Shellfish Immunology. 31, 716-724 (2011).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., et al. A Transgenic Zebrafish Model of Neutrophilic Inflammation. Blood. 13, 3976-3978 (2006).
- Mathias, J. R., Perrin, B. J., et al. Resolution of Inflammation by Retrograde Chemotaxis of Neutrophils in Transgenic Zebrafish. J. Leukoc. Biol. 6, 1281-1288 (2006).
- Ellett, F., Pase, L., et al. mpeg1 Promoter Transgenes Direct Macrophage-Lineage Expression in Zebrafish. Blood. 4, 56-56 (2011).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., et al. Specific Resistance to Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish is Mediated by the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator. Infect. Immun. 11, 4542 (2010).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., et al. Live Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Reveals Role of Phagocyte Oxidase in Limiting Filamentous Growth. Eukaryotic Cell. 7, 932-944 (2011).
- Rotman, J., van Gils, W., et al. Rapid Screening of Innate Immune Gene Expression in Zebrafish using Reverse Transcription – Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification. BMC Research Notes. 4, (2011).
- d’Alencon, C. A., Pena, O. A., et al. A High-Throughput Chemically Induced Inflammation Assay in Zebrafish. BMC Biology. 8, 151 (2010).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., et al. Development of a Respiratory Burst Assay using Zebrafish Kidneys and Embryos. Journal of Immunological Methods. 292, 119-129 (2004).
- Avdesh, A., Chen, M., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), e4196 (2012).
- Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051 (2012).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., et al. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
- Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and Unconventional Behavior of Neutrophils in Developing Zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
- Davidson, A. J., Zon, L. I. The ‘Definitive’ (and ‘Primitive’) Guide to Zebrafish Hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
- Jovanovic, B., Goetz, F. W., et al. Immunological Stimuli Change Expression of Genes and Neutrophil Function in Fathead Minnow Pimephales promelas Rafinesque. Journal of Fish Biology. 78, 1054-1072 (2011).
- Niethammer, P., Grabher, C., et al. A Tissue-Scale Gradient of Hydrogen Peroxide Mediates Rapid Wound Detection in Zebrafish. Nature. 459, 996-1000 (2009).
- Thisse, B., Pflumio, S., et al. Expression of the zebrafish genome during embryogenesis. (NIH R01 RR15402). ZFIN Direct Data Submission. , (2001).
- Thisse, B., Thisse, C. Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis. ZFIN Direct Data Submission. , (2004).
- . Table 18.4. The Molecular Probes Handbook. , .
