Quantification de la réponse du Rafale respiratoire comme indicateur d'Innate Immune Health chez le poisson zèbre

Le système immunitaire comprend deux branches: l'immunité innée et adaptative. L'immunité innée est évolutif plus ancienne que l'immunité adaptative. Invertébrés sont actuellement pensé pour avoir seulement l'immunité innée, alors que les vertébrés possèdent deux branches innées et adaptatives. Alors que l'immunité adaptative confère une immunité spécifique et de longue durée à certains agents pathogènes, l'immunité innée est une réponse immédiate aux bactéries envahissantes, les virus et les champignons. Un aspect crucial de la réponse immunitaire innée implique la libération de cytokines et de chimiokines, ce qui entraîne l'inflammation et le recrutement des phagocytes (par exemple, les macrophages, les neutrophiles) d'engloutir et de détruire les envahisseurs étrangers.

Réponses immunitaires innées qui réussissent comprennent: (1) la reconnaissance des micro-organismes envahisseurs; (2) l'induction des cascades de signalisation appropriées (par exemple de libération de cytokines et de chimiokines), (3) le développement approprié / un nombre suffisant de cellules phagocytaires; (4) Migration des phagocytes vers les sites d'infection; (5) l'engloutissement des agents pathogènes, et (6) la destruction des micro-organismes englouti. Une carence dans l'une quelconque de ces étapes pourrait conduire à l'hôte d'être submergé par, et de succomber à, l'infection. Une réponse immunitaire innée robuste est essentiel à la santé des organismes, car elle est la première ligne de défense contre les agents pathogènes dans les plantes et les animaux. Chez les vertébrés, il potentialise également la réponse immunitaire adaptative ^1. Par conséquent, il est essentiel que nous sommes en mesure d'évaluer tous les aspects de la réponse immunitaire innée afin de mieux comprendre et d'optimiser sa fonction.

De nombreux organismes modèles sont utilisés pour étudier l'immunité innée, allant de Arabadopsis à C. elegans à la drosophile à des souris à des cellules humaines en culture. Un avantage d'utiliser le poisson zèbre (Danio rerio) du système modèle pour étudier l'immunité innée, c'est que le poisson zèbre est un vertébré, avec im innée et acquisecommunauté, mais le développement de l'immunité innée et adaptative sont temporairement séparés. Poisson zèbre se fonder uniquement sur ​​l'immunité innée pour la protection contre l'infection jusqu'à ce que l'immunité adaptative devient entièrement fonctionnel, qui se produit autour de 4-6 semaines après la fécondation ^2. En plus des outils pour la manipulation génétique, la clarté optique et développement externe rapide, l'immunité innée comme le principal mode de défense dans embryons de poissons zèbres fournit un modèle simplifié dans lequel pour étudier la complexité de la réponse immunitaire innée in vivo.

Plusieurs protocoles ont été élaborés pour évaluer différentes facettes de la réponse immunitaire innée chez les embryons de poisson zèbre. Les puces à ADN ont validé RNAseq et que les profils de cytokines induites par la réponse immunitaire innée poisson zèbre sont similaires à celui des humains et ont également suggéré l'implication de gènes inattendus dans l'immunité innée ^3,4. La transparence de l'embryon de poisson zèbre et fluorescent, transgenic souches d'agents pathogènes et de poisson zèbre pour permettre la visualisation des interactions hôte-pathogène dynamiques in vivo en temps réel. Embryons de poisson zèbre transgénique exprimant la GFP sous le contrôle du promoteur spécifique de la myéloperoxydase des neutrophiles ou la ^{5,6-spécifique} des macrophages MPEG1 promoteur ⁷ ont permis de visualiser et de quantifier la migration des phagocytes à des sites d'infections localisées ⁸ ainsi que de visualiser la phagocytose et la destruction de marqué par fluorescence pathogènes ^8,9. Embryons de poisson zèbre sont également prêtent à la génération de tests à haut débit et les écrans chimiques. En conséquence, les méthodes d'analyse du transcriptome lors de l'infection ¹⁰ et migration des phagocytes à des sites de lésion induite chimiquement ¹¹ à haut débit ont récemment été mis au point.

Des techniques énumérées ci-dessus, aucun d'évaluer quantitativement l'étape finale de destruction d'agents pathogènes par les phagocytes. Cette dernière étapeimplique une salve respiratoire (c.-à-production de ROS et d'autres composés toxiques), qui tuent les agents pathogènes englouti. L'enzyme oxydase NADPH est une source majeure de ROS dans les cellules phagocytaires. L'assemblage des sous-unités des résultats d'enzyme NADPH oxydase dans le transfert d'électrons de l'oxygène, générer des anions superoxydes. Par des réactions enzymatiques suivantes, superoxyde peut ensuite être converti en peroxyde d'hydrogène et l'acide hypochloreux (Figure 1A). Il s'agit de la stimulation du métabolisme oxydatif des phagocytes qui tue les pathogènes, et donc, la quantification du potentiel de stimulation du métabolisme oxydatif des embryons de poisson zèbre est indicative de la santé globale immunitaire innée. Nous avons développé un test basé sur la fluorescence pour quantifier la salve respiratoire par groupes de ¹² embryons de poisson zèbre individuels. Ce test utilise la forme non fluorescente, la réduction d'un colorant disponible dans le commerce, la cellule-perméable. Ce colorant, 2 ', 7'-dichlorodihydrofluoresceine diacétate (H2DCFDA), est converti en la fluorescencecomposé de cent, 2 ', 7'-fluorescéine (DCF), lors de l'oxydation. Les diverses ROS générés par l'éclatement respiratoire des phagocytes peuvent oxyder H2DCFDA et générer une fluorescence ^24. L'apparition de fluorescence peut être utilisée pour quantifier et comparer la réponse de stimulation du métabolisme oxydatif entre les groupes de poisson-zèbre. L'agoniste de l'acétate myristate de phorbol protéine kinase C (PMA) est utilisé pour induire chimiquement la NADPH oxydase pour produire des ROS et d'augmenter ainsi des lectures de fluorescence (Figure 1B). Ici, nous fournissons un protocole détaillé d'une version modifiée et optimisée de ce dosage embryon de poisson zèbre stimulation du métabolisme oxydatif. Ce dosage peut être utilisé pour comparer la stimulation du métabolisme oxydatif entre les groupes d'embryons de poisson zèbre individuels au cours du temps et / ou en réponse à des manipulations expérimentales (par exemple morpholino knockdown médié par la protéine). L'utilisation de cette méthode, en conjonction avec d'autres tests de l'immunité innée de poisson zèbre, fournira une image plus complète du complexe et critiqueréponse immunitaire innée.