الكمي للاستجابة انفجر الجهاز التنفسي باعتبارها مؤشر الفطري المناعي الصحة في الزرد
Summary
الاستجابة المناعية الفطرية يحمي الكائنات الحية من الإصابة الممرض. وثمة عنصر حاسم من الاستجابة المناعية الفطرية، وانفجر الجهاز التنفسي بلعمية، وتولد أنواع الاكسجين التفاعلية التي تقتل الكائنات الدقيقة الغازية. نحن تصف مقايسة انفجر الجهاز التنفسي يحدد مقدار أنواع الاكسجين التفاعلية تنتج عندما يتم الناجم عن الاستجابة المناعية الفطرية كيميائيا.
Abstract
انفجار الجهاز التنفسي بلعمية هي جزء من الاستجابة المناعية الفطرية للإصابة الممرض وينطوي على إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS). ROS سامة وتعمل على قتل الكائنات الحية الدقيقة phagocytized. في الجسم الحي الكمي للالمشتقة بلعمية ROS يوفر معلومات بشأن قدرة الكائن الحي على شن استجابة مناعية فطرية قوية. نحن هنا وصف بروتوكول لتحديد ومقارنة ROS في الأجنة الزرد كله على الحث الكيميائي للانفجار الجهاز التنفسي بلعمية. هذا الأسلوب يجعل من استخدام مركب غير الفلورسنت التي يصبح الفلورسنت على الأكسدة التي كتبها ROS. و pipetted الأجنة الزرد الفردية في آبار من صفيحة ميكروسكوبية والمحتضنة في هذا الركيزة الفلورة مع أو من دون محفز الكيميائية للانفجار في الجهاز التنفسي. وكميا مضان في كل بئر في نقاط زمنية المطلوب باستخدام قارئ صفيحة ميكروسكوبية. تم تعديل قراءات مضان للقضاء على مضان الخلفية ثم شاركmpared باستخدام المفردة اختبار t. يسمح هذا الأسلوب للمقارنة من احتمال انفجار الجهاز التنفسي الأجنة الزرد في مراحل تنموية مختلفة وردا على التلاعب التجريبية مثل ضربة قاضية البروتين، من overexpression، أو العلاج مع وكلاء الدوائية. ويمكن أيضا أن هذه الطريقة يمكن استخدامها لمراقبة استجابة انفجر الجهاز التنفسي في الكلى تشريح كله أو مستحضرات خلية من الكلى من الزرد الكبار وبعض أنواع الأسماك الأخرى. ونحن نعتقد أن البساطة النسبية والقدرة على التكيف من هذا البروتوكول سوف تكمل البروتوكولات القائمة وسوف تكون ذات فائدة للباحثين الذين يسعون إلى فهم أفضل للاستجابة المناعية الفطرية.
Introduction
ويتكون الجهاز المناعي من فرعين: المناعة الفطرية والتكيفية. المناعة الفطرية هي أكثر تطويريا القديمة من الحصانة على التكيف. ويعتقد حاليا أن يكون اللافقاريات المناعة الفطرية فقط، في حين تمتلك كل من الفقاريات فروع الفطرية والتكيفية. في حين الحصانة التكيف يمنح الحصانة محددة وطويلة الأمد لبعض مسببات الأمراض، والحصانة الفطرية هو استجابة فورية لغزو البكتيريا، والفيروسات، والفطريات. أحد الجوانب الحاسمة للاستجابة المناعية الفطرية ينطوي على الإفراج عن السيتوكينات و chemokines، مما يؤدي إلى التهاب وتجنيد البالعات (مثل الضامة، العدلات) لابتلاع وتدمير الغزاة الأجانب.
الاستجابات المناعية الفطرية الناجحة تنطوي على: (1) الاعتراف الكائنات الدقيقة الغازية، (2) تحريض من أجهزة الطرد المركزي الإشارات المناسبة (على سبيل المثال الإفراج عن السيتوكينات وكيموكينات)، (3) التنمية السليمة / أعداد كافية من الخلايا البلعمية، (4) هجرة البالعات إلى مواقع الإصابة، (5) الإحاطة من مسببات الأمراض، و (6) تدمير الكائنات الحية الدقيقة غارقة. وهناك نقص في أي واحدة من هذه الخطوات يمكن أن تؤدي إلى المضيف طغيان، والخضوع ل، والعدوى. A الاستجابة المناعية الفطرية قوية أمر حيوي لصحة الكائنات الحية لأنها خط الدفاع الأول ضد مسببات الأمراض في جميع النباتات والحيوانات. في الفقاريات، فإنه يقوي أيضا الاستجابة المناعية التكيفية 1. لذا، فمن الأهمية بمكان أن نكون قادرين على تقييم جميع جوانب الاستجابة المناعية الفطرية من أجل فهم أفضل وذلك لتحسين وظيفتها.
وتستخدم العديد من الكائنات الحية نموذج لدراسة المناعة الفطرية، بدءا من Arabadopsis إلى C. ايليجانس لذبابة الفاكهة إلى الفئران إلى الخلايا البشرية المستزرعة. ميزة لاستخدام الزرد (دانيو rerio) نظام نموذجي لدراسة المناعة الفطرية هي أن الزرد هو الفقاريات، مع كل الفطرية والتكيفية ايمفقد المناعة، إلا أن تطور المناعة الفطرية والتكيفية يتم فصل زمنيا. الزرد تعتمد فقط على الحصانة الفطرية للوقاية من العدوى حتى يصبح الحصانة التكيف تعمل بكامل طاقتها، والذي يحدث بعد حوالي 4-6 أسابيع الإخصاب 2. بالإضافة إلى أدوات للتلاعب الجيني، والوضوح البصري، وتنمية الخارجية السريعة، والحصانة الفطرية كوضع مبدأ الدفاع في الأجنة الزرد توفر نموذج مبسط للدراسة تعقيدات الاستجابة المناعية الفطرية في الجسم الحي.
وقد وضعت بروتوكولات متعددة لتقييم جوانب مختلفة من الاستجابة المناعية الفطرية في الأجنة الزرد. والتحقق من صحتها وميكروأرس RNAseq أن ملامح خلوى التي تسببها الاستجابة المناعية الفطرية الزرد هي مماثلة لتلك التي للبشر ولقد اقترح أيضا إشراك الجينات غير متوقعة في المناعة الفطرية 3،4. شفافية الجنين الزرد والفلورسنت، transgenجيم سلالات من مسببات الأمراض والزرد تسمح لرؤية ديناميكية التفاعلات المضيف الممرض في الجسم الحي في الوقت الحقيقي. جعلت الأجنة الزرد المعدلة وراثيا معربا عن GFP تحت سيطرة العدلات محددة الميلوبيروكسيداز المروج 5،6 أو بلعم محددة MPEG1 المروج 7 من الممكن تصور وقياس الهجرة بلعمية إلى مواقع الالتهابات الموضعية 8 وكذلك لتصور البلعمة وتدمير fluorescently المسمى مسببات الأمراض 8،9. الأجنة الزرد هي أيضا قابلة للتوليد فحوصات عالية الإنتاجية وشاشات الكيميائية. وفقا لذلك، وقد تم مؤخرا تطوير أساليب إنتاجية عالية من التحليل Transcriptome على بناء 10 وإصابة الهجرة بلعمية إلى مواقع الإصابة التي يسببها كيميائيا 11.
من التقنيات المذكورة أعلاه، فإن أيا كميا تقييم المرحلة النهائية من الدمار من قبل الممرض البالعات. هذه المرحلة النهائيةينطوي على انفجار الجهاز التنفسي (أي إنتاج ريوس والمركبات السامة الأخرى)، والذي قتل مسببات الأمراض اجتاحت. أوكسيديز NADPH الانزيم هو المصدر الرئيسي للROS في الخلايا البلعمية. تجميع مفارز من نتائج انزيم أوكسيديز NADPH في نقل الإلكترونات إلى الأكسجين، وتوليد الأنيونات الفائق. من خلال التفاعلات الإنزيمية لاحقة، ويمكن بعد ذلك تحويلها الفائق في بيروكسيد الهيدروجين وحمض تحت الكلور (الشكل 1A). هو انفجار الجهاز التنفسي من البالعات الذي يقتل مسببات الأمراض وبالتالي، فإن القياس الكمي لإمكانات الجهاز التنفسي انفجار الأجنة الزرد يدل على صحة المناعة الفطرية بشكل عام. وضعنا مقايسة على أساس مضان لقياس انفجر الجهاز التنفسي في مجموعات من الأجنة الزرد الفردية 12. يستخدم هذا الاختبار في غير الفلورسنت، وانخفاض شكل، صبغة خلايا قابلة للاختراق متاحة تجاريا. هذه الصبغة، 2 '، 7'-dichlorodihydrofluorescein ثنائي الأسيتات (H2DCFDA)، يتم تحويلها إلى الفلوريةمجمع المائة، 2 '، 7'-dichlorofluorescein (DCF)، بناء على الأكسدة. يمكن للROS المتنوعة الناتجة عن انفجار الجهاز التنفسي بلعمية أكسدة H2DCFDA وتوليد مضان 24. ظهور مضان يمكن استخدامها لقياس ومقارنة استجابة انفجر الجهاز التنفسي بين مجموعات من الزرد. ويستخدم البروتين كيناز C خلات ناهض phorbol ميريستات (سلطة النقد الفلسطينية) للحث على كيميائيا أوكسيديز NADPH لإنتاج ريوس وبالتالي زيادة قراءات مضان (الشكل 1B). هنا، ونحن نقدم بروتوكول مفصلة من نسخة معدلة ومحسنة من هذا الجنين الزرد الجهاز التنفسي انفجار الفحص. هذا الاختبار يمكن استخدامها للمقارنة بين انفجار الجهاز التنفسي بين مجموعات من الأجنة الزرد الفردية مع مرور الوقت و / أو استجابة لالتلاعب التجريبية (مثل morpholino بوساطة البروتين ضربة قاضية). استخدام هذا الأسلوب، جنبا إلى جنب مع غيرها من فحوصات المناعة الفطرية الزرد، وتقديم صورة أكثر اكتمالا من المعقدة والحرجةالاستجابة المناعية الفطرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الوظيفة الأساسية للالبالعات هو الكشف، تبتلع، وتدمير مسببات الأمراض. قدرة البالعات لإنتاج انفجار الجهاز التنفسي أمر بالغ الأهمية الكافية لهذه المهمة. وبالتالي، القياس الكمي للاستجابة انفجار الجهاز التنفسي هو أسلوب واحد للسماح للمقارنة بين الصحة العامة والمناعة ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أنوه أعضاء في الماضي والحاضر من المختبر كيم، مارك Nilan للرعاية الزرد والصيانة، والدكتور روبرت ويلر لإجراء مناقشات مفيدة وتبادل البيانات، والمعاهد الوطنية للصحة منح 3RO1GM087308-02S1 و1P20RR024475-01A2 ومين الزراعية والغابات تجربة محطة (عدد النشر 3303) للحصول على التمويل.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| H2DCFDA | Sigma Aldrich | 35845-1G | |
| PMA | Fisher | BP6851 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2438-5X10ML | |
| Tricaine S MS222 | Western Chemical | 100 grams | |
| DMEM/F-12, No Phenol Red | Life Technologies | 11039-021 | |
| Deep Petri Dishes | VWR | 89107-632 | |
| Plastic Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| #5 Dumont Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
| 1.7 ml Micro Centrifuge Tubes | Axygen | 10011-724 | |
| 15 ml Conical Centrifuge Tubes | VWR | 21008-918 | |
| 5 ml Serological Pipettes | Greiner Bio One | 606180 | |
| Synergy 2 Multi-Mode Microplate Reader | BioTek | Contact BioTek | |
| Black 96 Well Microplate | VWR | 82050-728 | |
| 25 ml Sterile Reservoirs | VistaLab | 3054-2003 | |
| P200 Pipettor | Gilson | F123601 | |
| Multichannel Pipettor | VWR | 89079-948 | |
| Pipette Tips | VWR | 89079-478 |
References
- Medzhitov, R., Janeway, C. A. Innate Immunity: Impact on the Adaptive Immune Response. Current Opinion in Immunology. 9, 4-9 (1997).
- Lam, S. H., Chua, H. L., et al. Development and Maturation of the Immune System in Zebrafish, Danio rerio: A Gene expression Profiling. In Situ Hybridization and Immunological. 28, 9-28 (2004).
- Stockhammer, O. W., Zakrzewska, A., et al. Transcriptome Profiling and Functional Analyses of the Zebrafish Embryonic Innate Immune Response to Salmonella Infection. J Immunol. 9. 9, 5641-5653 (2009).
- Ordas, A., Hegedus, Z., et al. Deep Sequencing of the Innate Immune Transcriptomic Response of Zebrafish Embryos to Salmonella Infection. Fish & Shellfish Immunology. 31, 716-724 (2011).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., et al. A Transgenic Zebrafish Model of Neutrophilic Inflammation. Blood. 13, 3976-3978 (2006).
- Mathias, J. R., Perrin, B. J., et al. Resolution of Inflammation by Retrograde Chemotaxis of Neutrophils in Transgenic Zebrafish. J. Leukoc. Biol. 6, 1281-1288 (2006).
- Ellett, F., Pase, L., et al. mpeg1 Promoter Transgenes Direct Macrophage-Lineage Expression in Zebrafish. Blood. 4, 56-56 (2011).
- Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., et al. Specific Resistance to Pseudomonas aeruginosa Infection in Zebrafish is Mediated by the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator. Infect. Immun. 11, 4542 (2010).
- Brothers, K. M., Newman, Z. R., et al. Live Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Reveals Role of Phagocyte Oxidase in Limiting Filamentous Growth. Eukaryotic Cell. 7, 932-944 (2011).
- Rotman, J., van Gils, W., et al. Rapid Screening of Innate Immune Gene Expression in Zebrafish using Reverse Transcription – Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification. BMC Research Notes. 4, (2011).
- d’Alencon, C. A., Pena, O. A., et al. A High-Throughput Chemically Induced Inflammation Assay in Zebrafish. BMC Biology. 8, 151 (2010).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., et al. Development of a Respiratory Burst Assay using Zebrafish Kidneys and Embryos. Journal of Immunological Methods. 292, 119-129 (2004).
- Avdesh, A., Chen, M., et al. Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction. J. Vis. Exp. (69), e4196 (2012).
- Brothers, K. M., Wheeler, R. T. Non-invasive Imaging of Disseminated Candidiasis in Zebrafish Larvae. J. Vis. Exp. (65), e4051 (2012).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., et al. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
- Le Guyader, D., Redd, M. J., et al. Origins and Unconventional Behavior of Neutrophils in Developing Zebrafish. Blood. 111, 132-141 (2008).
- Davidson, A. J., Zon, L. I. The ‘Definitive’ (and ‘Primitive’) Guide to Zebrafish Hematopoiesis. Oncogene. 23, 7233-7246 (2004).
- Jovanovic, B., Goetz, F. W., et al. Immunological Stimuli Change Expression of Genes and Neutrophil Function in Fathead Minnow Pimephales promelas Rafinesque. Journal of Fish Biology. 78, 1054-1072 (2011).
- Niethammer, P., Grabher, C., et al. A Tissue-Scale Gradient of Hydrogen Peroxide Mediates Rapid Wound Detection in Zebrafish. Nature. 459, 996-1000 (2009).
- Thisse, B., Pflumio, S., et al. Expression of the zebrafish genome during embryogenesis. (NIH R01 RR15402). ZFIN Direct Data Submission. , (2001).
- Thisse, B., Thisse, C. Fast Release Clones: A High Throughput Expression Analysis. ZFIN Direct Data Submission. , (2004).
- . Table 18.4. The Molecular Probes Handbook. , .
