La stampa termosensibile Stampi inversa per la Creazione di Patterned idrogeli a due componenti per coltura cellulare 3D
Summary
Un bioprinter stato usato per creare idrogel patterned basato su uno stampo sacrificale. Lo stampo poloxamer stata riempita con un secondo idrogel e quindi eluita, lasciare vuoti che sono stati riempiti con una terza idrogel. Questo metodo utilizza eluizione veloce e buona stampabilità di polossalene di generare architetture complesse di biopolimeri.
Abstract
Bioprinting è una tecnologia emergente che ha le sue origini nel settore della prototipazione rapida. I diversi processi di stampa possono essere suddivisi in contatto bioprinting 1-4 (estrusione, dip penna e litografia soft), contactless bioprinting 5-7 (transfer laser in avanti, stampa a getto di deposizione) e tecniche basate laser come due fotoni fotopolimerizzazione 8. Può essere usato per molte applicazioni come ingegneria dei tessuti 9-13, 14-16 microfabbricazione biosensore e come strumento per rispondere a domande biologiche di base come influenze di co-coltura di tipi cellulari 17. A differenza dei metodi fotolitografiche o soft-litografica comuni, estrusione bioprinting ha il vantaggio che non richiede una maschera o timbro separato. Utilizzando il software CAD, la progettazione della struttura può essere rapidamente modificato e adeguato in funzione delle esigenze dell'operatore. Questo rende più flessibile che bioprinting litografia basataapprocci.
Qui mostriamo la stampa di uno stampo sacrificale per creare una struttura multi-materiale 3D utilizzando una matrice di colonne all'interno di un idrogel come esempio. Questi pilastri potrebbero rappresentare strutture cave per una rete vascolare o dei tubi all'interno di un condotto guida nervosa. Il materiale scelto per lo stampo sacrificale era polossamero 407, un polimero termosensibile con eccellenti proprietà di stampa che è liquido a 4 ° C e un solido sopra della sua temperatura di gelificazione ~ 20 ° C per 24,5% w / v soluzioni 18. Questa proprietà permette lo stampo sacrificale polossamero basata da eluito su richiesta e presenta vantaggi rispetto alla lenta dissoluzione di un materiale solido soprattutto per geometrie strette. Poloxamer è stato stampato su vetrini da microscopio per creare lo stampo sacrificale. Agarosio è stato pipettato nello stampo e raffreddato fino a gelificazione. Dopo l'eluizione del poloxamer in acqua ghiacciata, i vuoti nello stampo agarosio sono stati riempiti con alginato metacrilato spIked con FITC fibrinogeno marcato. I vuoti riempiti sono stati poi reticolato con raggi UV e il costrutto è stato ripreso con un microscopio a fluorescenza.
Introduction
Approcci di ingegneria tissutale hanno fatto molti progressi negli ultimi anni per quanto riguarda la rigenerazione di tessuti e organi umani 19,20. Tuttavia, finora, l'attenzione di ingegneria tissutale è stata spesso limitata ai tessuti che hanno una struttura semplice o piccole dimensioni come la vescica 21,22 o la pelle 23-25. Il corpo umano, tuttavia, contiene molti complessi tessuti tridimensionali in cui le cellule e matrice extracellulare sono disposte in modo spazialmente definito. Di produrre questi tessuti, è richiesta una tecnica che può collocare cellule e matrice extracellulare ponteggi all'interno di un costrutto tridimensionale in posizioni specificate. Bioprinting ha il potenziale di essere un tale tecnica in cui la visione di produzione complessi tessuti tridimensionali può essere realizzato 10,11,26-28.
Bioprinting è definito come "l'uso di processi di trasferimento di materiale per patterning e montaggio biologicamente relmateriali nenti – molecole, cellule, tessuti e di biomateriali biodegradabili. – con una organizzazione prescritto di realizzare una o più funzioni biologiche "4 Si comprende diverse tecniche che funzionano a diverse risoluzioni e le scale di lunghezza, che vanno dalla risoluzione sub-micron di due -fotone polimerizzazione 29 ad una risoluzione di 150 micron a 420 micron per la stampa estrusione 1,12,30. Non un unico materiale o combinazione di materiali in grado di soddisfare le esigenze di ciascun metodo 31. Per la stampa di estrusione, i parametri chiave sono viscosità e tempo di gelificazione 32, dove l'alta viscosità e rapido gelificazione sono desiderabili.
Stampa 3D è una tecnica che permette la facile creazione di stampi sacrificali per la creazione di geometrie complesse 30,33,34. Questo processo si basa sulla realizzazione di uno stampo utilizzando una tecnica di prototipazione rapida, come un bioprinter estrusione. Lo stampo sacrificale creata viene utilizzataper formare strutture complesse da materiali che sono difficili da stampare a causa della loro bassa viscosità e tempo di gelificazione lento. Il metodo qui presentato prevede la realizzazione di uno stampo sacrificale costituito da un materiale che si dissolve rapidamente a bassa temperatura e può essere estrusa con precisione. Il copolimero a blocchi poli (etilene glicole) 99-poli (propilene glicole) 67-poli (glicole etilenico) 99 (noto anche come Pluronic F127 o poloxamer 407) soddisfa questi requisiti. Esso è già stato usato in una versione modificata nella stampa estrusione 1 ma, a nostra conoscenza, non è mai stata utilizzata per la stampa nella sua versione non modificata a causa della sua instabilità in ambienti liquidi. Polossamero 407 mostra anche un inverso termico comportamento reattivo 18, vale a dire che cambia da un gel ad un sol sul raffreddamento. La cosa più importante, può essere stampato in complesse strutture arbitrariamente curve ad altissima fedeltà. Ciò permette la creazione di un idrogel strutturata da unamateriale a bassa viscosità, in questo caso lento gelificazione agarosio, pipettando la soluzione nello stampo sacrificale stampato. La combinazione di stampa stampo sacrificale con alta fedeltà e l'eluizione rapida dall'idrogel strutturato colato rende un metodo veloce e flessibile per creare stampi con geometrie diverse, senza l'uso di una maschera o un timbro come è spesso richiesto in metodi litografici. L'idrogel strutturato colato può essere ulteriormente riempito con un altro materiale che non è adatto per la stampa estrusione a causa della sua bassa viscosità. Questo è nel nostro caso una soluzione di alginato metacrilato bassa viscosità. Qui vi presentiamo il metodo di termosensibile stampi sacrificali inversa per idrogel patterning con l'esempio di una matrice colonna.
Protocol
Representative Results
Discussion
Presentiamo qui, per la prima volta, l'uso di un polimero termosensibile per uno stampo sacrificale che può essere rapidamente eluita in acqua fredda a causa del gel-sol transizione di poloxamer di ~ 20 ° C. La velocità dell'intero processo rende polossamero interessante per la rapida creazione di strutture biopolimero che non può essere stampato con una risoluzione adeguata. La tecnica qui descritta può essere utilizzata per patterning un idrogel idrogel all'interno di un altro o per la creazione di ca…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Deborah Studer per l'aiuto con il bioprinter.
Il lavoro è stato finanziato dal Programma dell'Unione Europea Settimo programma quadro (FP7/2007-2013) convenzione di sovvenzione n ° NMP4-SL-2009-229.292.
Materials
| REAGENTS | |||
| Poloxamer (Pluronic F127) | Sigma | P2443 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-015 | |
| CAD software | regenHU | BioCAD | |
| Alginate methacrylate | Innovent e.V Technologieentwicklung Jena | Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292 | |
| Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | F13191 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Innovent e.V Technologieentwicklung Jena | Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| EQUIPMENT | |||
| Bioprinter | regenHU | Biofactory | |
| Valve | regenHU | 300 μm Nozzel Diameter | |
| Needle | regenHU | 150 μm Inner Diameter | |
| Zeiss Axioobserver with ApoTome | Zeiss | ||
| UV Light Source | UVP | Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp | 100 W |
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