הדפסת תבניות היפוך Thermoresponsive ליצירת בדוגמת הידרוג דו רכיבים-תרבות תאי 3D
Summary
Bioprinter שימש ליצירה הידרוג דוגמת המבוסס על תבנית עולה. עובש poloxamer היה backfilled עם הידרוג'ל שני ולאחר מכן eluted, ומשאיר חללים שהיו מלאים בידרוג'ל שלישי. שיטה זו משתמשת elution המהיר וטוב של printability poloxamer לייצר ארכיטקטורות מורכבות מbiopolymers.
Abstract
Bioprinting הוא טכנולוגיה מתפתחת שמקורו בתעשיית אב הטיפוס והדגמים. תהליכי ההדפסה השונים ניתן לחלק לbioprinting קשר 1-4 (שחול, לטבול עט ויתוגרפיה הרכה), ללא מגע (העברה קדימה לייזר, מדפסות הזרקת דיו בתצהיר) 5-7 bioprinting וטכניקות מבוססות לייזר כגון שני photopolymerization פוטון 8. זה יכול לשמש ליישומים רבים כגון הנדסת רקמות 9-13, 14-16 microfabrication biosensor וככלי כדי לענות על שאלות בסיסיות ביולוגיות כגון השפעות של שיתוף culturing של תאים מסוגים שונים 17. בניגוד לשיטות photolithographic או רכת יתוגרפיות נפוצות, יש bioprinting חול יתרון שהוא אינו מחייב את מסכה נפרדת או בול. שימוש בתוכנות CAD, העיצוב של המבנה יכול להיות שונה במהירות ומותאם לפי הדרישות של המפעיל. זה עושה bioprinting גמיש יותר מבוסס יתוגרפיהגישות.
כאן אנו מדגימים את הדפוס של עובש ההקרבה ליצור מבנה 3D חומר רב באמצעות מערך של עמודים בתוך הידרוג'ל לדוגמא ירושלים. עמודים אלה יכולים לייצג מבנים חלולים לרשת כלי דם או את הצינורות בתוך צינור מדריך עצב. החומר שנבחר לעובש ההקרבה היה 407 poloxamer, פולימר thermoresponsive עם מאפייני הדפסה מעולים שהוא נוזלי על 4 מעלות צלזיוס ומוצקה מעל טמפרטורת gelation ~ 20 מעלות צלזיוס במשך 24.5% w / v 18 פתרונות. מאפיין זה מאפשר עובש ההקרבה מבוסס poloxamer להיות eluted על פי דרישה ויש לו יתרונות על פני הפירוק האיטי של חומר מוצק במיוחד עבור גיאומטריות צרות. Poloxamer היה מודפס על שקופיות זכוכית מיקרוסקופ כדי ליצור את התבנית העולה. Agarose הייתה pipetted לתוך התבנית ומקוררת עד gelation. לאחר elution של poloxamer במים קרים כקרח, את החללים בעובש agarose היו מלאים באלגינט methacrylate SPiked עם פיברינוגן המסומן FITC. החללים המלאים היו אז צולבים עם UV והמבנה היה צילמו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי עלית.
Introduction
הנדסת רקמות גישות עשו התקדמות רבה בשנים האחרונות ביחס להתחדשות של רקמות ואיברים 19,20 אדם. עם זאת, עד עכשיו, את הפוקוס של הנדסת רקמות כבר לעתים קרובות מוגבל לרקמות שיש להם מבנה פשוט או ממדים קטנים כגון שלפוחית 21,22 או עור 23-25. גוף האדם, לעומת זאת, מכיל רקמות רבות תלת ממדיות מורכבות שבו תאים ומטריצה תאית מסודרים באופן מוגדר במרחב. כדי לייצר רקמות אלה, נדרש טכניקה שיכולה למקם את תאים ופיגומי מטריקס בתוך מבנה תלת ממדים בעמדות שצוינו. יש Bioprinting את הפוטנציאל להיות כזה טכניקה שבו החזון של רקמות תלת ממדיות מורכבות ייצור יכול להתממש 10,11,26-28.
Bioprinting מוגדר "שימוש בתהליכי העברת חומר לדפוסים והרכבה ביולוגי relחומרי evant – מולקולות, תאים, רקמות, וbiomaterials מתכלה. – עם ארגון שנקבע לביצוע פונקציות ביולוגיות אחד או יותר "4 היא כוללת מספר טכניקות שונות שעובדים ברזולוציות שונות וקשקשת אורך, החל הרזולוציה תת מיקרון של שתיים פוטון פילמור 29 לרזולוציה של 150 מיקרומטר עד 420 מיקרומטר להדפסת חול 1,12,30. לא חומר יחיד או בשילוב חומר יהיה לספק את הדרישות של כל שיטה 31. לדפוס שחול, הפרמטרים העיקריים הם צמיגות וזמן gelation 32, שבו צמיגות גבוהה וgelation המהיר הם רצויות.
הדפסת 3D היא טכניקה המאפשרת יצירה קלה של תבניות ההקרבה ליצירת גיאומטריות מורכבות 30,33,34. תהליך זה מבוסס על הבנייה של תבנית בעזרת טכניקת דיגום מהירה כגון bioprinter חול. משמש עובש ההקרבה יצרליצירת מבנים מורכבים מחומרים שקשה להדפיס עקב הצמיגות הנמוכה שלהם וזמן gelation איטי. השיטה שהוצגה כאן כרוכה ביצירה של עובש ההקרבה בהיקף של חומר שמתמוסס במהירות בטמפרטורה נמוכה ויכולים להיות נמתח בצורה מדויקת. בלוק קופולימר פולי (אתילן גליקול) 99 פולי (פרופילן גליקול) 67 פולי (אתילן גליקול) 99 (הידוע גם בPluronic F127 או poloxamer 407) ממלא את הדרישות הללו. זה כבר נעשה שימוש בגרסה שונה בדפוס 1 חול, אבל, למיטב ידיעתנו, אף פעם לא הייתה בשימוש להדפסה בגרסתה ללא שינוי עקב חוסר היציבות שלה בסביבות נוזליות. Poloxamer 407 גם מראה התנהגות הפוכה תגובה תרמית 18 כלומר היא משתנה מג'ל לסול בקירור. והכי חשוב, זה יכול להיות מודפס למבנים מעוקלים באופן שרירותי מורכבים עם נאמנות גבוהה מאוד. זה מאפשר יצירה של הידרוג'ל מובנה מחומר בעל צמיגות נמוך, במקרה זה איטי gelling agarose, על ידי pipetting הפתרון לתוך תבנית ההקרבה המודפסת. שילוב של הדפסת עובש ההקרבה עם איכות גבוהה והמהיר שלה מelution הידרוג'ל המובנה casted עושה את זה בשיטה מהירה וגמישה ליצירת תבניות בגיאומטריות שונות, ללא שימוש במסכה או חותמת כפי שהוא נדרש לעתים קרובות בשיטות יתוגרפיות. הידרוג'ל המובנה casted יכול להיות מלא יותר בחומר אחר שאינו מתאים לדפוס שחול עקב הצמיגות הנמוכה שלה. זה במקרה שלנו פתרון methacrylate אלגינט צמיגות נמוך. כאן אנו מציגים את השיטה של תבניות ההקרבה הפוכות thermoresponsive לדפוסי הידרוג'ל באמצעות הדוגמא של מערך אומנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן אנו מציגים, בפעם הראשונה, השימוש בפולימר thermoresponsive לעובש ההקרבה שניתן eluted במהירות במים קרים בשל המעבר ג'ל סול של poloxamer של ~ 20 ° C. המהירות של התהליך כולו הופכת למעניינת poloxamer יצירה המהירה של מבני biopolymer שלא ניתן להדפיס ברזולוציה מספקת. הטכניקה שתוארה כאן יכולה לשמש ל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לדבורה Studer לעזרה עם bioprinter.
העבודה מומנה על ידי תכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP7/2007-2013) תחת הסכם המענק N ° NMP4-SL-2009-229,292.
Materials
| REAGENTS | |||
| Poloxamer (Pluronic F127) | Sigma | P2443 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-015 | |
| CAD software | regenHU | BioCAD | |
| Alginate methacrylate | Innovent e.V Technologieentwicklung Jena | Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292 | |
| Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | F13191 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Innovent e.V Technologieentwicklung Jena | Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| EQUIPMENT | |||
| Bioprinter | regenHU | Biofactory | |
| Valve | regenHU | 300 μm Nozzel Diameter | |
| Needle | regenHU | 150 μm Inner Diameter | |
| Zeiss Axioobserver with ApoTome | Zeiss | ||
| UV Light Source | UVP | Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp | 100 W |
References
- Fedorovich, N. E., et al. Evaluation of photocrosslinked Lutrol hydrogel for tissue printing applications. Biomacromolecules. 10, 1689-1696 (2009).
- Lee, K. B., Park, S. J., Mirkin, C. A. Protein nanoarrays generated by Dip-Pen Nanolithography. Abstr Pap Am Chem S. 223, C94 (2002).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual review of biomedical engineering. 3, 335-373 (2001).
- Mironov, V., Reis, N., Derby, B. Review: bioprinting: a beginning. Tissue engineering. 12, 631-634 (2006).
- Odde, D. J., Renn, M. J. Laser-guided direct writing of living cells. Biotechnology and bioengineering. 67, 312-318 (2000).
- Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J Mater Chem. 18, 5717-5721 (1039).
- Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nature. 2, 265-271 (2003).
- Engelhardt, S., et al. Fabrication of 2D protein microstructures and 3D polymer-protein hybrid microstructures by two-photon polymerization. Biofabrication. 3, 025003 (2011).
- Mironov, V. Printing technology to produce living tissue. Expert opinion on biological therapy. 3, 701-704 (2003).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regenerative medicine. 3, 93-103 (2008).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current opinion in biotechnology. 22, 667-673 (2011).
- Fedorovich, N. E., De Wijn, J. R., Verbout, A. J., Alblas, J., Dhert, W. J. Three-dimensional fiber deposition of cell-laden, viable, patterned constructs for bone tissue printing. Tissue engineering. Part A. 14, 127-133 (2008).
- Dhariwala, B., Hunt, E., Boland, T. Rapid prototyping of tissue-engineering constructs, using photopolymerizable hydrogels and stereolithography. Tissue engineering. 10, 1316-1322 (2004).
- Cook, C., Wang, T., Derby, B. Inkjet Printing of Enzymes for Glucose Biosensors. Mater Res Soc Symp P. 1191, 103-109 (2009).
- Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol Lett. , 1-7 (2012).
- Wang, T. M., Cook, C., Derby, B. Fabrication of a Glucose Biosensor by Piezoelectric Inkjet Printing. , 82-85 (2009).
- Shim, J. H., Lee, J. S., Kim, J. Y., Cho, D. W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. J. Micromech. Microeng. 22, (2012).
- Malmsten, M., Lindman, B. Self-Assembly in Aqueous Block Copolymer Solutions. Macromolecules. 25, 5440-5445 (1021).
- Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, I132-I137 (2006).
- Matsumura, G., Hibino, N., Ikada, Y., Kurosawa, H., Shin’oka, T. Successful application of tissue engineered vascular autografts: clinical experience. Biomaterials. 24, 2303-2308 (2003).
- Kropp, B. P., Zwischenberger, J. B. Tissue-engineered autologous bladders: new possibilities for cystoplasty. Nature clinical practice. Urology. 3, 588-589 (2006).
- Oberpenning, F., Meng, J., Yoo, J. J., Atala, A. De novo reconstitution of a functional mammalian urinary bladder by tissue engineering. Nature. 17, 149-155 (1999).
- Wood, F. Tissue engineering of skin. Clinics in plastic surgery. 39, 21-32 (2012).
- Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering–in vivo and in vitro applications. Clinics in plastic surgery. 39, 33-58 (2012).
- Bannasch, H., Momeni, A., Knam, F., Stark, G. B., Fohn, M. Tissue engineering of skin substitutes. Panminerva medica. 47, 53-60 (2005).
- Jakab, K., Neagu, A., Mironov, V., Forgacs, G. Organ printing: fiction or science. Biorheology. 41, 371-375 (2004).
- Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. The anatomical record. Part A, Discoveries in molecular, cellular, and evolutionary biology. 272, 497-502 (2003).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
- Raimondi, M. T., et al. Two-photon laser polymerization: from fundamentals to biomedical application in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of applied biomaterials. 10, 56-66 (2012).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature. 11, 768-774 (2012).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. Journal of biomedical materials research. Part A. 101, 272-284 (2013).
- He, J., Li, D., Liu, Y., Gong, H., Lu, B. Indirect fabrication of microstructured chitosan-gelatin scaffolds using rapid prototyping. Virtual and Physical Prototyping. 3, 159-166 (2008).
- Sachlos, E., Reis, N., Ainsley, C., Derby, B., Czernuszka, J. T. Novel collagen scaffolds with predefined internal morphology made by solid freeform fabrication. Biomaterials. 24, 1487-1497 (2003).
- Lee, W., et al. On-demand three-dimensional freeform fabrication of multi-layered hydrogel scaffold with fluidic channels. Biotechnology and bioengineering. 105, 1178-1186 (2010).
- Turturro, M., Christenson, M., Larson, J., Papavasiliou, G. Matrix metalloproteinase (MMP) sensitive PEG diacrylate (PEGDA) hydrogels with spatial variations in matrix properties direct vascular cell invasion. J. Tissue. 6, 302-302 (2012).
- Butterworth, A., Garcia, M. D. L., Beebe, D. Photopolymerized poly(ethylene) glycol diacrylate (PEGDA) microfluidic devices. Roy. Soc. Ch. , 4-6 (2005).
- Shachar, M., Tsur-Gang, O., Dvir, T., Leor, J., Cohen, S. The effect of immobilized RGD peptide in alginate scaffolds on cardiac tissue engineering. Acta biomaterialia. 7, 152-162 (2011).
- Jeon, O., Bouhadir, K. H., Mansour, J. M., Alsberg, E. Photocrosslinked alginate hydrogels with tunable biodegradation rates and mechanical properties. Biomaterials. 30, 2724-2734 (2009).
- Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng-T Asme. 122, 252-260 (2000).
- D’Arrigo, G., et al. Hyaluronic acid methacrylate derivatives and calcium alginate interpenetrated hydrogel networks for biomedical applications: physico-chemical characterization and protein release. Colloid Polym. Sci. 290, 1575-1582 (2012).
- Pescosolido, L., et al. Hyaluronic Acid and Dextran-Based Semi-IPN Hydrogels as Biomaterials for Bioprinting. Biomacromolecules. 12, 1831-1838 (2011).
- Guo, Y., et al. Hydrogels of collagen/chondroitin sulfate/hyaluronan interpenetrating polymer network for cartilage tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 23, 2267-2279 (2012).
