Afdrukken warmteresponsieve Reverse Mallen voor de schepping van Patterned Hydrogelen Twee-component voor 3D Cell Culture
Summary
Een bioprinter werd gebruikt om gevormde hydrogelen gebaseerd op een offer mal maken. De poloxamer mal werd opgevuld met een tweede hydrogel en vervolgens geëlueerd, waardoor holtes die gevuld waren met een derde hydrogel. Deze methode maakt gebruik van snelle elutie en goede bedrukbaarheid van poloxameer om complexe architecturen uit biopolymeren genereren.
Abstract
Bioprinting is een opkomende technologie die zijn oorsprong in de rapid prototyping-industrie heeft. De verschillende drukprocessen kunnen worden onderverdeeld in contact bioprinting 1-4 (extrusie, dip pen en zachte lithografie), contactloze bioprinting 5-7 (het laser overdracht, ink-jet depositie) en laser gebaseerde technieken zoals twee foton fotopolymerisatie 8. Het kan worden gebruikt voor vele toepassingen zoals tissue engineering 9-13, 14-16 biosensor microfabricage en als instrument voor fundamentele biologische vragen als invloeden van co-kweken van verschillende celtypes 17 beantwoorden. In tegenstelling tot gewone fotolithografische of soft-lithografische methoden, extrusie bioprinting heeft het voordeel dat geen afzonderlijke masker of stempel vereist. Behulp van CAD-software, kan het ontwerp van de constructie snel worden gewijzigd en aangepast aan de wensen van de operator. Dit maakt bioprinting flexibeler dan lithografie-basedbenaderingen.
Hier laten we het afdrukken van een offer mal om een multi-materiaal 3D structuur met behulp van een reeks zuilen in een hydrogel als voorbeeld maken. Deze pijlers kunnen holle structuren vormen voor een vasculair netwerk of de buizen binnen een zenuwgeleider leiding. Voor de wijze offeren vormmateriaal was poloxameer 407, een warmteresponsieve polymeer met uitstekende drukeigenschappen dat vloeibaar is bij 4 ° C en een vast boven de geleringstemperatuur ~ 20 ° C 24,5% w / v oplossing 18. Deze eigenschap maakt het poloxameer-based offer mal te worden geëlueerd op aanvraag en heeft voordelen ten opzichte van de langzame ontbinding van een vast materiaal speciaal voor smalle geometrieën. Poloxamer werd op microscoop glasplaatjes gedrukt om het offer mal te maken. Agarose werd gepipetteerd in de mal en afgekoeld tot gelering. Na elutie van de poloxameer in ijskoud water, werden de holten in de agarose mal gevuld met alginaat methacrylaat spiked met FITC gelabeld fibrinogeen. De gevulde holten werden daarna verknoopt met UV en het construct werd afgebeeld met een epi-fluorescentie microscoop.
Introduction
Tissue engineering benaderingen hebben veel vooruitgang geboekt in de afgelopen jaren met betrekking tot de regeneratie van menselijke weefsels en organen 19,20. Tot nu toe, de focus van tissue engineering is vaak beperkt tot weefsels die een eenvoudige structuur of kleine afmetingen, zoals de blaas of de huid 21,22 23-25 hebben. Het menselijk lichaam bevat echter vele complexe driedimensionale weefsels waar cellen en extracellulaire matrix zijn gerangschikt in een ruimtelijk gedefinieerde manier. Om deze weefsels te vervaardigen, is een techniek vereist die cellen en extracellulaire matrix steiger kan uitgaan van een driedimensionaal construct op gespecificeerde plaatsen. Bioprinting heeft het potentieel om een dergelijke techniek waarbij het beeld van de vervaardiging van complexe driedimensionale weefsels worden gerealiseerd 10,11,26-28 zijn.
Bioprinting wordt gedefinieerd als "het gebruik van materiaal overdrachtsprocessen voor patroonvorming en monteren biologisch relfende materialen – moleculen, cellen, weefsels, en bioafbreekbare materialen -. een voorgeschreven organisatie een of meer biologische functies "4 bereiken Het omvat verschillende technieken die werken bij verschillende resoluties en lengteschalen, van de sub-micron resolutie van twee -foton polymerisatie 29 op een resolutie van 150 micrometer tot 420 micrometer voor extrusie afdrukken 1,12,30. Geen enkel materiaal of materiaal combinatie zal voldoen aan de eisen van elke methode 31. Voor extrusie afdrukken, de belangrijkste parameters zijn viscositeit en geleringstijd 32, waar een hoge viscositeit en snelle gelering gewenst.
3D printen is een techniek die de gemakkelijke creatie van opofferende mallen voor het maken van complexe geometrieën 30,33,34 mogelijk maakt. Dit proces is gebaseerd op de constructie van een vorm met een snelle prototyping zoals een extrusie bioprinter. De gecreëerd offer mal wordt gebruiktom complexe structuren te vormen uit materialen die moeilijk mogelijk wegens hun lage viscositeit en langzaam geltijd zijn. De hier gepresenteerde methode omvat de vorming van een offer mal bestaat uit een materiaal dat snel oplost bij lage temperatuur nauwkeurig kan worden geëxtrudeerd. Het blokcopolymeer poly (ethyleenglycol) 99-poly (propyleenglycol) 67-poly (ethyleenglycol) 99 (ook bekend als Pluronic F127 of poloxameer 407) voldoet aan deze eisen. Er is reeds gebruikt in een gemodificeerde versie extrusie drukken 1 maar voor zover wij weten, nooit gebruikt voor het afdrukken in de ongewijzigde versie vanwege zijn instabiliteit in vloeibare omgeving. Poloxamer 407 toont ook een inverse thermisch responsief gedrag 18 dwz verandert van een gel naar een sol bij afkoeling. Het belangrijkste is, kan het in complexe willekeurig gebogen structuren worden geprint met een zeer hoge betrouwbaarheid. Dit maakt de creatie van een gestructureerde hydrogel uit eenmateriaal met lage viscositeit, in casu langzaam gelerend agarose bepaling, waarbij de oplossing in de gedrukte offer mal. De combinatie van het drukken van de opofferende mal met hoge betrouwbaarheid en snelle elutie van de gegoten structuur hydrogel laat een snelle en flexibele manier om schimmels te creëren met verschillende geometrieën zonder gebruik van een masker of een stempel zoals vaak vereist lithografische methoden. De gegoten gestructureerde hydrogel kan verder worden gevuld met een ander materiaal dat niet geschikt is voor extrusie druk vanwege de lage viscositeit. Dit is in ons geval een lage viscositeit alginaat methacrylaat oplossing. Hier presenteren we de werkwijze thermoresponsieve reverse offer matrijzen voor hydrogel patroonvorming het voorbeeld van een zuil array.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier presenteren we voor het eerst het gebruik van een warmteresponsieve polymeer voor een offer schimmel die snel kan worden geëlueerd in koud water door de gel-sol overgang van poloxameer van ~ 20 ° C. De snelheid van het gehele proces maakt poloxameer interessant dat spoedig biopolymeer structuren die niet worden bedrukt met voldoende resolutie. De hier beschreven techniek kan worden gebruikt voor patroonvorming een hydrogel in elkaar hydrogel of voor het maken van microfluïdische kanalen zoals eerder beschreven v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Deborah Studer voor de hulp bij de bioprinter.
Het werk werd gefinancierd door de Europese Unie Zevende Kaderprogramma (FP7/2007-2013) onder subsidieovereenkomst n ° NMP4-SL-2009-229292.
Materials
| REAGENTS | |||
| Poloxamer (Pluronic F127) | Sigma | P2443 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-015 | |
| CAD software | regenHU | BioCAD | |
| Alginate methacrylate | Innovent e.V Technologieentwicklung Jena | Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292 | |
| Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate | Invitrogen | F13191 | |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Innovent e.V Technologieentwicklung Jena | Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| EQUIPMENT | |||
| Bioprinter | regenHU | Biofactory | |
| Valve | regenHU | 300 μm Nozzel Diameter | |
| Needle | regenHU | 150 μm Inner Diameter | |
| Zeiss Axioobserver with ApoTome | Zeiss | ||
| UV Light Source | UVP | Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp | 100 W |
References
- Fedorovich, N. E., et al. Evaluation of photocrosslinked Lutrol hydrogel for tissue printing applications. Biomacromolecules. 10, 1689-1696 (2009).
- Lee, K. B., Park, S. J., Mirkin, C. A. Protein nanoarrays generated by Dip-Pen Nanolithography. Abstr Pap Am Chem S. 223, C94 (2002).
- Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual review of biomedical engineering. 3, 335-373 (2001).
- Mironov, V., Reis, N., Derby, B. Review: bioprinting: a beginning. Tissue engineering. 12, 631-634 (2006).
- Odde, D. J., Renn, M. J. Laser-guided direct writing of living cells. Biotechnology and bioengineering. 67, 312-318 (2000).
- Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J Mater Chem. 18, 5717-5721 (1039).
- Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nature. 2, 265-271 (2003).
- Engelhardt, S., et al. Fabrication of 2D protein microstructures and 3D polymer-protein hybrid microstructures by two-photon polymerization. Biofabrication. 3, 025003 (2011).
- Mironov, V. Printing technology to produce living tissue. Expert opinion on biological therapy. 3, 701-704 (2003).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regenerative medicine. 3, 93-103 (2008).
- Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current opinion in biotechnology. 22, 667-673 (2011).
- Fedorovich, N. E., De Wijn, J. R., Verbout, A. J., Alblas, J., Dhert, W. J. Three-dimensional fiber deposition of cell-laden, viable, patterned constructs for bone tissue printing. Tissue engineering. Part A. 14, 127-133 (2008).
- Dhariwala, B., Hunt, E., Boland, T. Rapid prototyping of tissue-engineering constructs, using photopolymerizable hydrogels and stereolithography. Tissue engineering. 10, 1316-1322 (2004).
- Cook, C., Wang, T., Derby, B. Inkjet Printing of Enzymes for Glucose Biosensors. Mater Res Soc Symp P. 1191, 103-109 (2009).
- Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol Lett. , 1-7 (2012).
- Wang, T. M., Cook, C., Derby, B. Fabrication of a Glucose Biosensor by Piezoelectric Inkjet Printing. , 82-85 (2009).
- Shim, J. H., Lee, J. S., Kim, J. Y., Cho, D. W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. J. Micromech. Microeng. 22, (2012).
- Malmsten, M., Lindman, B. Self-Assembly in Aqueous Block Copolymer Solutions. Macromolecules. 25, 5440-5445 (1021).
- Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, I132-I137 (2006).
- Matsumura, G., Hibino, N., Ikada, Y., Kurosawa, H., Shin’oka, T. Successful application of tissue engineered vascular autografts: clinical experience. Biomaterials. 24, 2303-2308 (2003).
- Kropp, B. P., Zwischenberger, J. B. Tissue-engineered autologous bladders: new possibilities for cystoplasty. Nature clinical practice. Urology. 3, 588-589 (2006).
- Oberpenning, F., Meng, J., Yoo, J. J., Atala, A. De novo reconstitution of a functional mammalian urinary bladder by tissue engineering. Nature. 17, 149-155 (1999).
- Wood, F. Tissue engineering of skin. Clinics in plastic surgery. 39, 21-32 (2012).
- Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering–in vivo and in vitro applications. Clinics in plastic surgery. 39, 33-58 (2012).
- Bannasch, H., Momeni, A., Knam, F., Stark, G. B., Fohn, M. Tissue engineering of skin substitutes. Panminerva medica. 47, 53-60 (2005).
- Jakab, K., Neagu, A., Mironov, V., Forgacs, G. Organ printing: fiction or science. Biorheology. 41, 371-375 (2004).
- Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. The anatomical record. Part A, Discoveries in molecular, cellular, and evolutionary biology. 272, 497-502 (2003).
- Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
- Raimondi, M. T., et al. Two-photon laser polymerization: from fundamentals to biomedical application in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of applied biomaterials. 10, 56-66 (2012).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature. 11, 768-774 (2012).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
- Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. Journal of biomedical materials research. Part A. 101, 272-284 (2013).
- He, J., Li, D., Liu, Y., Gong, H., Lu, B. Indirect fabrication of microstructured chitosan-gelatin scaffolds using rapid prototyping. Virtual and Physical Prototyping. 3, 159-166 (2008).
- Sachlos, E., Reis, N., Ainsley, C., Derby, B., Czernuszka, J. T. Novel collagen scaffolds with predefined internal morphology made by solid freeform fabrication. Biomaterials. 24, 1487-1497 (2003).
- Lee, W., et al. On-demand three-dimensional freeform fabrication of multi-layered hydrogel scaffold with fluidic channels. Biotechnology and bioengineering. 105, 1178-1186 (2010).
- Turturro, M., Christenson, M., Larson, J., Papavasiliou, G. Matrix metalloproteinase (MMP) sensitive PEG diacrylate (PEGDA) hydrogels with spatial variations in matrix properties direct vascular cell invasion. J. Tissue. 6, 302-302 (2012).
- Butterworth, A., Garcia, M. D. L., Beebe, D. Photopolymerized poly(ethylene) glycol diacrylate (PEGDA) microfluidic devices. Roy. Soc. Ch. , 4-6 (2005).
- Shachar, M., Tsur-Gang, O., Dvir, T., Leor, J., Cohen, S. The effect of immobilized RGD peptide in alginate scaffolds on cardiac tissue engineering. Acta biomaterialia. 7, 152-162 (2011).
- Jeon, O., Bouhadir, K. H., Mansour, J. M., Alsberg, E. Photocrosslinked alginate hydrogels with tunable biodegradation rates and mechanical properties. Biomaterials. 30, 2724-2734 (2009).
- Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng-T Asme. 122, 252-260 (2000).
- D’Arrigo, G., et al. Hyaluronic acid methacrylate derivatives and calcium alginate interpenetrated hydrogel networks for biomedical applications: physico-chemical characterization and protein release. Colloid Polym. Sci. 290, 1575-1582 (2012).
- Pescosolido, L., et al. Hyaluronic Acid and Dextran-Based Semi-IPN Hydrogels as Biomaterials for Bioprinting. Biomacromolecules. 12, 1831-1838 (2011).
- Guo, Y., et al. Hydrogels of collagen/chondroitin sulfate/hyaluronan interpenetrating polymer network for cartilage tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 23, 2267-2279 (2012).
