Gram-negatif bakterilerin izolasyonu ve Lipid A kimyasal karakterizasyonu

Lipopolisakarid (LPS) neredeyse tüm gram-negatif bakterilerin en büyük dış yüzey molekülü olan ve üç molekül etki oluşmaktadır: merkezden uzak bir O-antijen polisakarit, çekirdek oligosakkarit ve zara bağlı lipid dış yaprakçıkta biriken bir etki dış zar iki tabakalı ^1,2. Lipid A ^alanı, lipid A yumuşak asit hidrolizi ¹ üzerine LPS'nin kloroform çözünür bölümü olarak tanımlanabilir 3-deoksi-D-manno-okt-2-ulosonic (Kdo) artıkları ve bir lipit A moleküler türün oluşmaktadır ^2. Model organizma Escherichia coli (E. coli), ^1,2 gözlenen büyük lipid A türleri ile tutarlıdır; standart lipid A molekül kimyasal heksa-asilatlanmış ve bis-fosforile edilmiş olan bir omurga diglucosamine olarak tanımlanabilir. Gram-negatif bakteriler boyunca muhafaza edilmiş dokuz kurucu olarak ifade edilen genler, lipid üretiminde bir alanı (Şekil 1), ^1,2 sorumludur. Bir çok bakteri lipid A ³ daha başka kimyasal modifikasyonu katılma filogenetik koruma derecesi değişebilir genlerin ek dizi vardır. Defosforilasyon, asil zincirleri çıkarılması ve amino şekerler (örneğin amino-arabinoz) ve / veya fosfoetanolamin gibi kimyasal kısımların ve buna ek olarak en sık gözlemlenen etkinlikleri ve (Şekil 1) bulunmaktadır. Lipid A modifikasyonu sorumlu enzimlerin çoğu doğrudan bu iki değerli katyonları gibi tabiata ait sinyallerle aktive edilir, ya da sentezleme, iki bileşenli tepki düzenleyici sistemler ³ düzenlenir.

Host doğuştan gelen bağışıklık sistemi tarafından lipid A türlerin tanınması Toll-benzeri reseptör 4/myeloid farklılaşma faktörü 2 (TLR4/MD2) co-reseptör ⁴ aracılık eder. MD2 ve lipid A asil zincirleri, aynı zamanda, TLR4 ve lipid A 1 ve 4 ', fosfat grupları dudağın güçlü bir ilişki teşvik arasında var olan hidrofobik kuvvetler^{TLR4/MD2, 4,5} ile kimliği bir. Asilasyon durum ya da lipid A negatif yük etki TLR4/MD2 göre lipid değiştirmek modifikasyonlar A tanıma ve doğal bağışıklık yanıtının uyarılması alt NF-KB ve örneğin TNFa ve ^{IL1-β, 6,7} enflamasyon medyatörleri harekete geçiriciler kullanılmaktadır. Lipid A'nın negatif şarjının maskelenmesini modifikasyonları da hücre yüzeyleri ^3,8 gram-negatif bakteri bağlanmasını katyonik antimikrobiyal peptitler engeller. Birçok lipid A modifikasyon örneğin, insan ev sahibi içinde veya ekolojik bir niş gibi özel çevre koşulları altında, bakteri sağlığını arttırmak için öne sürülmüştür. Bu nedenle birçok modifikasyon enzimleri antimikrobiyal bileşiklerin rasyonel gelişme çekici hedeflerdir. Lipid A yapılarının kimyasal çeşitliliği, organizma ve / veya çevreye ve bu çeşitli yapıların biyolojik etkileri ile ilgili olarak lipid A'nın yapısal karakterizasyonu t önemli bir çaba yapmakO gram-negatif bakterilerin çalışma.

Bütün bakterilerden lipid A molekülleri izolasyonu nihai saflaştırma prosedürü ^9-11 ardından bakteriyel hücre yüzeyinden LPS'nin çıkarma, lipit A serbest bırakmak için bir hidrolitik aşamasını içerir. En sık atıf LPS ekstraksiyon prosedürü ilk Westphal ve Jann ¹⁰ tarafından tanıtılan, sıcak-fenol su çıkarma işlemdir. Bütün kimyasal olarak ekstre LPS lipid A'nın uzak glukozamin şeker (Şekil 1) 6'-hidroksil KDO ayıran hafif asit hidrolize tabi sonra. Çok sayıda tuzaklar yüksek bir tehlike reaktifin kullanılması da dahil olmak üzere, sıcak-fenol su prosedürü için mevcut ko-ekstre edilmiş nükleik asitler ve proteinler, ve birkaç gün indirgeme için ihtiyaç protokolü ¹⁰ tamamlamak için gereklidir.

İlk Caroff ve Raetz ^12,13 tarafından geliştirilen Bizim laboratuvar ayrıca lipid A'nın çıkarma ve izole geliştirdi. Sıcak-fenol su işlemleri ile karşılaştırıldığında, burada sunulan yöntem daha hızlı ve daha verimli ve 5 ml birden litre kültür hacimleri geniş bir aralıkta. Ayrıca, sıcak fenol su ekstresini aksine, bizim yöntem lipit A türlerin optimal iyileşme sağlayan, LPS kaba veya pürüzsüz türleri için seçmez. Protokolde, bütün bir bakteri hücrelerinin kimyasal liziz LPS, santrifüjle topaklar haline edilebilir bir kloroform, metanol ve sudan oluşan bir karışımı kullanılarak gerçekleştirilir. Hafif asit hidrolize ve solvent ekstraksiyon (Bligh-Dyer) içinde bir arada kovalent bağlı polisakarit lipit A serbest bırakmak için kullanılır. Bligh ve Dyer bir yöntem ilk olarak ^14, dokular, hayvan ve bitki çeşitli lipid türlerin çıkarılması için uygulanan bu son adımda ayırma lipid A'dan hidrolize polisakarit ayırmak için burada modifiye edilmiş, kloroform çözünür lipidler seçici bir alt organik bir şekilde bölünmezler aşaması. Bundan başka, lipid A saflaştırılması için ters fazlı ya daAnyonik değiştirme kolon kromatografisi ¹² kullanılabilir.

Tüm hücrelerden lipid A türlerinin izole edildikten sonra, analitik bir dizi yöntem bu NMR ve TLC ve MS-esaslı analizi gibi izole edilmiş malzemenin kimyasal yapısını karakterize etmek için kullanılabilir. NMR tahribatsız yapısal açıklama için izin verir, ve glikosidik bağlantıları, asil zinciri pozisyonların kesin atama ve amino-arabinozun veya fosfoetanolamin ^15-17 gibi lipit A değişiklikler için ek siteler ödevle ilgili yapısal ayrıntı sağlar. Lipid A'nın NMR analizi eden protokol içinde ele değildir, fakat başka ^15,16 yeterince tarif edilmiştir. Hızlı analiz için TLC yöntemler sıkça kullanılır dayalı, ama ince kimyasal yapısına ilişkin doğrudan bilgi sağlamak için başarısız. MS temel protokoller lipid A yapıları ^18,19 karakterize etmek için en çok kullanılan bir yöntemdir. Matrix ilişkili lazer desorpsiyon iyonizasyon (MALDI)-MS genellikle başlangıçta sağlam lipit A türlerini araştırmak için kullanılır. Tek yüklü iyonların daha analit eden ekstraksiyon prosedürlere göre hazırlanmıştır oluşturulur. Daha ince yapısal analiz gerekli olduğu gibi, MS / MS tabanlı yöntemler MALDI-MS'den daha bilgilendirici kanıtlamak. Yapısal bilgi ürün iyonları ^18,20,21 oluşturmak için, (ESI) bir ön-madde iyonları Çarpışmanın neden olduğu ayırma (CID) ya da mor ötesi Fotodissosiasyon (UVPD) ile daha da parçalanmış olan, tek başına veya çok yüklü lipid iyonizasyon elektrosprey Akuple. Bir ön-madde iyonları lipid Nötr kaybı ürünler ayrıca sık sık yapısal bilgileri ve ek bir tabaka sağlayan ESI-MS sırasında oluşturulur.

Tandem kütle spektrometrisi (MS / MS) lipid A yapıların açıklanması için vazgeçilmez ve çok yönlü bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. MS / MS sırasında, ön-madde iyonları iyon yapısını aydınlatmak için kullanılabilecek bir tanı parçalanma desen vermek üzere aktive olur. En yaygın olarak available MS / MS metodu olup CID. Bu yöntem, ayrışma yol açar enerji birikimi ile sonuçlanır, bir atıl gaz ile, hedef seçilen haberci iyon çarpışmaları yolu ile parçası iyonlar üretir. CID bakteri türlerinin ^22-33 geniş bir yelpazesi için bir lipid yapının atama önemli bir araç olduğunu kanıtlamıştır.

CID en evrensel olarak uygulanan MS / MS metodu da, bu ürün, iyonların sınırlı dizisi oluşturur. 193 nm UVPD alternatif ve tamamlayıcı bir MS / MS yöntemi. Bu yöntem iyon ışın tedavisi için bir lazer kullanmaktadır ve fotonların emme iyonları ve sonraki ayrışma enerjilendirilmesi ile sonuçlanır. Bu yüksek enerji, MS / MS tekniği CID daha ürün iyonların daha çeşitli bir dizi üretir ve böylece daha bilgilendirici parçalanma desen sağlar. Özellikle, UVPD glukan, amin, asil ve CC bağlantılı tahviller ^18,21,34 de bölünmelere dayalı lipid A türlerde ince değişiklikler hakkında bilgi verir.