Выделение и химическая характеристика липида А из грамотрицательных бактерий

Липополисахарид (LPS) является основным внешняя поверхность молекула почти всех грамотрицательных микроорганизмов и состоит из трех доменов: молекулярных дистальный O-антиген полисахаридов, основной олигосахаридных, и мембранно-связанный липидов домена осаждается на внешней створки Внешняя мембрана двухслойная ^1,2. Липидный домен состоит из 3-дезокси-D-манно-окт-2-ulosonic (KDO) остатков и липида A видов молекул, где липид может быть определена как хлороформ растворимой части ЛПС при легкой кислотного гидролиза ^{1, 2.} Стандарт липидов молекула может быть химически определяется как diglucosamine позвоночника, что является гекса-ацилирована и бис-фосфорилируются; согласуется с основными видами липида А, наблюдаемых в модель организма кишечной палочки (E.coli) ^1,2. Девять конституитивно выраженные гены, консервативные по всей грамотрицательных бактерий, несут ответственность за производство липидов домена (рис. 1) ^1,2. Большинство бактерий имеют дополнительный набор генов, которые изменяются в степени филогенетического сохранения, что участвовать в дальнейшей химической модификации липидов ^3. Дефосфорилирование, удаление ацильных цепей, и добавление химических групп, таких как аминосахаров (например aminoarabinose) и / или фосфоэтаноламин являются наиболее часто наблюдается деятельности (рис. 1). Многие из ферментов, ответственных за липидов модификации непосредственно активировать окружающей среды сигналов, таких как двухвалентные катионы, или их экспрессия регулируется двухкомпонентных ответ-регуляторных систем ^3.

Признание видов липидов А принимающей врожденной иммунной системы опосредуется звонок подобный рецептор фактора 4/myeloid дифференциации 2 (TLR4/MD2) корецептора ^4. Гидрофобные силы между MD2 и липида A ацильных цепей, а также между TLR4 и 1 и 4 'фосфатными группами липида А способствующих сильную связь для губID с TLR4/MD2 ^4,5. Модификации, которые изменяют состояние ацилирования или отрицательный заряд липидов липидов на основе воздействия TLR4/MD2 признание и вниз по течению стимуляция врожденного иммунного ответа активаторы NF-kB и медиаторы воспаления, такие как TNF-и IL-1 β ^6,7. Модификации, которые маскируют отрицательный заряд липида А также предотвратить бактерицидными катионные антимикробные пептиды от привязки к грамотрицательных поверхности клеток ^3,8. Многие модификации липидов A предположили увеличить бактериальную фитнес при определенных условиях окружающей среды, таких как внутри человеческого организма или в экологической ниши. По этой причине многие модификации ферменты привлекательными объектами в рациональной разработке антимикробных соединений. Химический разнообразие структур липида А, в отношении организма и / или окружающей среды и биологических последствий этих различных структур сделать структурную характеристику липида А важным стремиться в тон изучению грамотрицательных бактерий.

Выделение молекул липида А из цельных бактерий включает экстракцию ЛПС от поверхности бактериальной клетки, стадии гидролиза, чтобы освободить липидный A, с последующим окончательным процедуры очистки ^9-11. Наиболее часто приводимые ЛПС процесс экстракции процедура забора воды горячей фенол, впервые введенная Вестфаль и Янн ^10. После экстракции весь LPS подвергают легкой кислотного гидролиза, который химически отделяет Kdo от 6'-гидроксила дистального глюкозамина сахара липида А (рис. 1). Существует множество подводных камней для процедуры воды горячей фенола том числе с использованием высокой реагента опасности, необходимость ухудшить сотрудничество извлеченные нуклеиновых кислот и белков, и несколько дней, необходимых для завершения протокол ^10.

Наша лаборатория дальнейшее развитие добычи и изоляцию липида А как впервые разработана Карофф и Raetz ^12,13. По сравнению с процедурами горячей воды фенол, метод, представленный здесь является более быстрым и эффективным, и вмещает широкий спектр объемов культуры от 5 мл до нескольких литров. Кроме того, в отличие от экстракции горячей фенольных водных, наш метод не выбрать для грубых или гладких-типов ЛПС, обеспечивая оптимальное восстановление видов липидов А. В нашем протокола, химической лизис бактериальных клеток целых выполняется с использованием смеси хлороформа, метанола и воды, где LPS может быть осаждают центрифугированием. Сочетание гидролиза легкой кислоты и экстракции растворителем (Блай-Дайер) используются, чтобы освободить липидный А из ковалентно связанного полисахарида. Способ Блаем и Dyer впервые был применен к добыче видов липидов из различных животных и растительных тканей ^14, модифицированный здесь, чтобы отделить гидролизованный полисахарид из липидов А. В этом заключительном этапе разделения, хлороформ растворимые липиды селективно разделить на нижний органический фаза. Для дальнейшей очистки липид А, с обращенной фазой илиАнионный обмен колоночной хроматографии можно использовать ^12.

После выделения липидов А из видов целых клеток, ряд аналитических методов может быть использован, чтобы охарактеризовать химическую структуру изолированного материала, такого как ЯМР, ТСХ и МС на основе анализа. ЯМР позволяет неразрушающего структурного анализа, и обеспечивает структурную деталь, связанную с гликозидных связей, однозначного присвоения ацильных позиций цепи, и назначение участков присоединения для липидных модификаций А ​​как aminoarabinose или фосфоэтаноламин ^15-17. ЯМР-анализ липида А не обсуждается в рамках нашего протокола, но был описан адекватно в другом месте ^15,16. Для экспресс-анализа ТСХ Методы, основанные на часто используются, но не в состоянии обеспечить прямую информацию о тонкой химической структуры. Протоколы, основанные МС наиболее часто используется метод для характеристики структуры липидов ^18,19. Матрица связано с лазерной десорбцией ионизации (MALDI)-MS часто используется для обследования первоначально интактные видов липида А. Однозарядных ионов сгенерированы анализируемого вещества, полученного в соответствии с нашими процедурами экстракции. Как требуется более тонкая структурный анализ, методы, основанные MS / MS оказаться более информативным, чем MALDI-MS. В сочетании с ионизацией электрораспылением (ESI), отдельно или многозарядных липид А ионы-предшественники являются еще фрагментирован на столкновения индуцированной диссоциации (CID) или ультрафиолетового фотодиссоциации (UVPD), для генерации структурно информативные ионы продукта ^18,20,21. Обычный потери продуктов из липида А предшествующих ионов также часто генерируется во время ESI-MS обеспечивает дополнительный слой структурной информации.

Масс-спектрометрия Тандем (MS / MS), оказалось, незаменимым и универсальным методом для выяснения структуры липида А. Во MS / MS, ионы активируются, чтобы получить диагностическую картину фрагментации, которая может использоваться для выяснения структуру иона-предшественника. Наиболее широко лавинтестированию нет доступа метод MS / MS является CID. Этот метод производит ионы фрагментов через столкновениях выбранного иона-предшественника с инертным целевого газа, в результате чего энерговклада, что приводит к диссоциации. CID доказала критический инструмент в присвоении липидной структуры A для широкого круга видов бактерий ^22-33.

Хотя CID является наиболее широко реализованы способ МС / МС, он генерирует ограниченный спектр ионов продукта. 193 нм UVPD является альтернативой и дополнительный метод MS / MS. Этот метод использует лазер для облучения ионами, и поглощение фотонов приводит к подаче напряжения ионов и последующей диссоциации. Это более высокая энергия MS / MS техника производит более разнообразные ионов продукции, чем CID и таким образом обеспечивает более информативные модели фрагментации. В частности, UVPD дает информацию о тонких изменений в видов липидов А на основе раскола в гликозидной, амин, ацил и CC облигаций, привязанных к ^18,21,34.