בידוד ואפיון כימי ליפידים מחיידקים גראם שליליים

Lipopolysaccharide (LPS) הוא מולקולת המשטח החיצונית העיקרית של כמעט כל יצורי גרם שלילי והוא מורכב משלושה תחומים מולקולריים: פוליסכריד דיסטלי O-אנטיגן, oligosaccharide ליבה, והשומנים בדם הקרום הקשורים תחום שהופקד על העלון החיצוני של ^1,2 bilayer קרום חיצוני. השומנים תחום מורכב משאריות 3-deoxy-D-manno באוק '2-ulosonic (Kdo) ושומני מינים מולקולריים, שבו שומנים בדם יכול להיות מוגדרים כחלק מסיס בכלורופורם של LPS על הידרוליזה מתונה חומצת ^{1, 2.} השומנים סטנדרטיים מולקולה יכולים להיות מוגדרים כימי כמו עמוד השדרה diglucosamine שהוא וbis-פוספורילציה-acylated שש; בקנה אחד עם מיני שומנים העיקריים שנצפו בcoli אורגניזם מודל Escherichia coli (E. coli) ^1,2. תשעה גנים הביעו constitutively, נשמרו לאורך כל חיידקים גראם שלילית, הם אחראים לייצור של השומנים בדם תחום (איור 1) ^1,2. רוב החיידקים סט נוסף של גנים, אשר משתנה במידת שימור פילוגנטי, המשתתפים בשינוי כימי נוסף של שומנים בדם ^3. Dephosphorylation, הסרת חלק מרשתות acyl, והתוספת של moieties הכימי כגון סוכרים אמינו (למשל aminoarabinose) ו / או phosphoethanolamine הן הפעילויות (איור 1) נצפה הנפוצות ביותר. רבים מהאנזימים האחראים לשומני שינוי מופעלים ישירות על ידי אותות סביבתיים, כגון קטיונים דו ערכיים, או הביטוי שלהם מוסדר על ידי שתי מערכות תגובת רגולטור רכיב ^3.

הכרה של מיני שומנים בדם על ידי מערכת החיסון המולדת המארח מתווכת על ידי גורם הקולטן חיוג כמו בידול 4/myeloid 2 (TLR4/MD2) שיתוף קולט ^4. כוחות הידרופובי בין MD2 והשומנים בדם רשתות acyl, כמו גם בין TLR4 וקבוצות 1 ו -4 "פוספט של שומנים בדם לקדם את הקשר החזק של שפהid עם TLR4/MD2 ^4,5. שינויים שמשנים את מצב acylation או המטען השלילי של שומנים שומנים מבוססי ההשפעה TLR4/MD2 הכרה וגירוי במורד הזרם של תגובת החיסון המולדת מטהרי NF-κB ומתווכים של דלקת כגון TNFα ^ו6,7 IL1-β. שינויים שלהסוות את המטען השלילי של שומנים בדם גם למנוע פפטידים מיקרוביאלית קטיוני bactericidal מלהיקשר לגראם שלילי משטחי תא ^3,8. שינויי שומנים רבים שיערו להגדיל את כושר חיידקים בתנאים סביבתיים מסוימים, כגון בתוך המארח האנושי או בנישה אקולוגית. מסיבה זו אנזימי שינוי רבים הם מטרות אטרקטיביות בפיתוח רציונלים של תרכובות מיקרוביאלית. הגיוון הכימי של מבני שומנים בדם, ביחס לאורגניזם ו / או בסביבה, ואת ההשלכות הביולוגיות של המבנים המגוונים הללו להפוך את האפיון המבני של שומנים בדם חשוב במאמץ לאהוא לומד של חיידקי גרם שלילי.

בידוד של מולקולות שומנים מכל חיידקים כרוך החילוץ של LPS מתא השטח בקטריאלי, צעד hydrolytic לשחרר את השומנים בדם, ואחרי הליך טיהור סופי ^9-11. מצוטט לעתים קרובות ביותר הליך מיצוי LPS הוא הליך המיצוי במים החם-פנול, הוצג לראשונה על ידי סטפל וג'אן ^10. לאחר כל LPS חילוץ נתונה הידרוליזה מתונה חומצה, אשר כימי מפרידה Kdo מ6'-הידרוקסיל של סוכר גלוקוזאמין הדיסטלי של שומנים בדם (איור 1). החסרונות רבים קיימים להליך המים חם פנול כוללים השימוש במגיב מפגע גבוה, הצורך להשפיל חומצות המופקים במשותף גרעין וחלבונים, וכמה ימים נדרשים כדי להשלים את הפרוטוקול ^10.

המעבדה שלנו פיתחה עוד יותר את החילוץ ובידוד של שומנים בדם כפי שפותח לראשונה על ידי Caroff וRaetz ^12,13. בהשוואה לנהלי מים חם פנול, השיטה המוצגת כאן היא מהירה ויעילה יותר ולהכיל מגוון רחב של נפחי תרבות מ5 מיליליטר לליטר מרובה. יתר על כן, בניגוד לעקירות מים חם פנול, השיטה שלנו לא בוחר למחוספס או חלקת סוגי LPS, מתן התאוששות אופטימלית של מיני שומנים בדם. בפרוטוקול שלנו, תמוגה הכימית של תאי חיידקיים שלמים מתבצעת באמצעות תערובת של כלורופורם, מתנול ומים, שבו ניתן pelleted LPS על ידי צנטריפוגה. שילוב של הידרוליזה מתונה חומצה ועקירות ממס (בליי-Dyer) משמשים לשחרור שומנים מפוליסכריד המצורף קוולנטית. השיטה של ליי ודאייר הוחלה לראשונה המיצוי של מיני שומנים ממגוון רחב של בעלי חיים וצמחי רקמות ^14, הותאמו כאן להפריד פוליסכריד שעבר הידרוליזה מא שומנים בדם בשלב הפרדה סופי, שומנים מסיסים כלורופורם לחלק באופן סלקטיבי לאורגניים נמוך שלב. כדי לטהר עוד יותר שומנים בדם, הפוך שלב אוכרומטוגרפיה בעמודת מטבע אניוני יכולה לשמש ^12.

לאחר הבידוד של מיני שומנים מכל תאים, במספר שיטות אנליטיות יכול לשמש כדי לאפיין את המבנה הכימי של חומר המבודד כגון תמ"ג, TLC, וניתוח המבוסס על MS. NMR מאפשר להבהרה מבנית שאינו הרסנית, ומספק פירוט מבני הקשורים לקשרי glycosidic, הקצאה חד משמעית של עמדות שרשרת acyl, והמחאת האתרים מצורפים לשינויים שומנים בדם כמו aminoarabinose או phosphoethanolamine ^15-17. ניתוח NMR של שומנים לא נדון בפרוטוקול שלנו, אבל כבר תאר כראוי במקומות אחרים ^15,16. לניתוח מהיר TLC מבוסס שיטות משמשות לעתים קרובות, אך אינו מספק מידע ישיר לגבי מבנה כימי בסדר. פרוטוקולים מבוססים MS הם השיטה המועסק בתדירות הגבוהה ביותר על מנת לאפיין מבני שומנים ^18,19. יינון לייזר desorption מטריקס משויך (MALDI)-MS משמש לעתים קרובות בתחילה סקר מיני שומנים בדם בשלמותה. יונים טעונים ביחידים נוצרים מאנליטי נערך בהתאם לנהלי החילוץ שלנו. כפי שנדרש ניתוח מבני עדין יותר, המבוססות על שיטות MS / MS להוכיח אינפורמטיבי יותר מאשר MALDI-MS. מצמידים את electrospray יינון שומנים ביחידים או להכפיל טעונים יונים מבשר הם מקוטעים עוד יותר על ידי ניתוק התנגשות מושרה (CID) או photodissociation אולטרה סגול (UVPD) (ESI), כדי ליצור יוני מוצר מבני אינפורמטיבי ^18,20,21. מוצרי אובדן ניטראליים משומנים בדם יונים מבשר גם בתדירות גבוהה שנוצרו במהלך ESI-MS מספקים שכבה נוספת של מידע מבני.

ספקטרומטריית טנדם מסה (MS / MS) הוכיחה להיות שיטה הכרחית ותכליתית להבהרה של מבני שומנים בדם. במהלך MS / MS, יונים מופעלים להניב דפוס פיצול אבחון שניתן להשתמש בם על מנת להבהיר את המבנה של יון המבשר. אווה נרחבת ביותרשיטת MS / MS ilable היא CID. שיטה זו מייצרת יונים שבר באמצעות התנגשויות של היונים המבשר הנבחרים עם גז אינרטי יעד, וכתוצאה מכך בתצהיר אנרגיה שמוביל לניתוק. CID הוכיח כלי קריטי בהקצאה של מבנה שומנים בדם למגוון רחב של מיני חיידקים ^22-33.

למרות CID הוא שיטת MS / MS מיושם ביותר האוניברסלית, זה יוצר מערך מוגבל של יוני מוצר. 193 UVPD ננומטר הוא אלטרנטיבה ושיטת MS / MS משלים. בשיטה זו נעשה שימוש בליזר כדי להקרין יונים, והקליטה של ​​פוטונים התוצאה energization של היונים וניתוק שלאחר מכן. טכניקת MS / MS זה אנרגיה גבוהה יותר מייצרת מערך מגוון יותר של יוני מוצר מאשר CID ובכך מספקת דפוסי פיצול יותר אינפורמטיבי. בפרט, UVPD מעניק מידע על שינויים עדינים במינים שומנים המבוססים על שסעים בglycosidic, אמין, acyl ואיגרות חוב צמודות CC ^18,21,34.