La manipolazione genetica in<em> Δku80</em> Ceppi per analisi genomica funzionale di<em> Toxoplasma gondii</em

1. Gene Targeting per eliminare un gene di interesse Questo protocollo è progettato per la generazione efficiente di un ceppo mutante che ha una delezione mirata gene ad un locus genetico definito. Il T. precedentemente descritta gondii ipoxantina-xantina-guanina fosforibosiltransferasi (HXGPRT) marcatore di selezione viene utilizzata in questo protocollo per la sicurezza e affidabilità inserimento marcatore dopo acido micofenolico e xantina (MPA + X) selezione 14-16. Questo protocollo utilizza un metodo convalidato e conveniente per la costruzione di molecole di DNA di targeting basate su lievito clonazione recombinational 17,18. Diversi protocolli alternativi sono disponibili in commercio per la costruzione di molecole ricombinanti di targeting utilizzando metodi di clonazione ricombinazione batterica, in vitro metodi di clonazione ricombinazione o fusione PCR. Il protocollo descritto di seguito fornisce la massima efficienza e l'affidabilità di recuperare clonato parasITES in possesso di una delezione genica mirata a Δ ku80 ceppi di T. gondii. 1.1 Preparazione di mira DNA Accedere ToxoDB 6 ( http://www.toxodb.org ) per ottenere sequenze genomiche per il gene di interesse (GOI). Nota: sequenze genomiche devono essere ottenuti dal tipo I, II o III del genoma sequenza del database ToxoDB che è più vicino al ceppo viene manipolato. Per esempio: GT1 per RH e ME49 per Pru. Progettazione sovrapposizione primer specifici che amplificano il 5 'e 3' genomiche fianchi di targeting del gene di interesse (GOI) che incorpora un 33 bp sovrapposizione con la navetta lievito vettore pRS416 (o in alternativa pRS426) e incorporano un 33 bp sovrapposizione con il marcatore selezionabile ( HXGPRT) (Figure 1A-B). Aggiungere un sito unico di enzima di restrizione in ogni primer ad entrambe le estremità 5 'unfianchi genomiche ° 3 'di targeting, posto tra i 33 bp sovrapposizione e il T. gondii-specifica sequenza di innesco (s) (Figure 1A-B). Nota: una è richiesto maggiore di 30 bp per sovrapposizione efficiente lievito ricombinazione clonazione. Il 5 'e 3' fianchi rivolte genomici sono progettati per amplificare frammenti di DNA specifici tra 800 e 1400 bp che definiscono una delezione mirata. Essere consapevoli del fatto che i fianchi più brevi riducono significativamente l'efficienza di mira nel Δ Δ ku80 hxgprt sfondo 2. PCR amplifica il 5 'fianco di destinazione utilizzando primer F1 e R1, e la PCR amplifica il 3' fianco di destinazione utilizzando Primer F2 e R2 (Figure 1A-C) da DNA genomico 3. Separatamente, PCR amplificare il gene Kbp 2 ~ HXPGRT compresa associati 5 'e 3' DHFR regioni fiancheggianti della cassetta HXGPRT pminiHXGPRT 14 cDNA utilizzando primer HXF e HXR(Figure 1B-C). Nota: Amplify fianchi di destinazione utilizzando il DNA genomico dal ceppo parentale per essere transfettate. Nota: posizionare il marcatore HXGPRT nell'orientamento avanti rispetto al 5 'e 3' del DNA di targeting fianchi per facilitare le successive manipolazioni genetiche efficienti, come la rimozione mirata di HXGPRT dal locus perturbato. Verificare corretti formati del prodotto di PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio e di stimare la concentrazione di frammento di DNA usando standard di gel di agarosio o un altro metodo per determinare la concentrazione di DNA. Generare aliquote lievito competenti, come descritto nella Gietz e Schiestly 17. Combinare 50 ng di 5 'genomica fianco di targeting, 50 ng di 3' fianco di targeting genomico, 100 ng di HXGPRT marcatore di selezione, e 50 ng di vettore shuttle linearizzato con sterile H 2 O per ottenere un volume finale di 10 -20 microlitri. Trasforma lievito competente con i tre prodotti di PCR e lievito-E. coli navetta vettore per il clonaggio recombinational utilizzando il protocollo descritto da Gietz e Schiestly 17. Piastra trasformato lievito su piastre di agar minime medie uracile-minus e incubare a 30 ° C per 2-3 giorni. Nota: Il montaggio ordinata del plasmide, il 5 'bersaglio fianco, il marcatore HXGPRT, e il 3' fianco bersaglio è facilitata dalle ingegnerizzati 33 bp sovrapposizione tra i frammenti di DNA (Figure 1A-B) ed è mediata da ricombinazione omologa in lievito. Harvest lievito con l'aggiunta di 2 ml di 2x YPAD alle piastre uracile-minus e delicatamente raschiare per sloggiare colonie senza interrompere l'agar. Centrifugare la soluzione di lieviti per 5 min a 5000 xg ed eliminare il surnatante. Risospendere il pellet di lievito in 250 ml di un tampone di risospensione contenente RNaseA e aggiungere 50 – 100 ml di unacid-washed perle di vetro alla soluzione. Vortex per 5 minuti alla massima velocità per distruggere le cellule di lievito. Lasciare le perle di vetro di depositarsi sul fondo della provetta e trasferire il surnatante in una provetta da 2 Eppendorf. Isolare DNA di lievito usando un kit di isolamento di DNA miniprep, risospensione in un volume finale di 100 microlitri ~. Miscelare 2 ml di DNA di lievito (~ 50 ng) con 40 ml di DH10B elettroporazione competente E. coli tenuti in ghiaccio. Trasferire la soluzione in un refrigerata 2 millimetri divario elettroporazione cuvetta ed elettroporazione di cellule batteriche di 2,4 kV e 129 Ω. Cellule di soccorso con l'aggiunta di 0,8 ml di SOC brodo per ogni cuvetta e la soluzione di trasferimento di un 14 ml tappo a scatto tubo Falcon. Incubare le cellule a 37 ° C su un tamburo a rulli per 40 – 60 min. Piastra E. coli su + ampicillina piastre 2xYT (AMP) e incubare le piastre a 37 ° C durante la notte. Selezionare ~ 6-8 singole colonie e crescere in 3 ml 2xYT + AMP per ~ 16 ore a 37 ° C. <li> Preparare un 30% di glicerolo congelatore magazzino di ogni E. coli clone. Isolare pΔGOI plasmide di E. cloni coli utilizzando un kit miniprep, risospensione in un volume finale di 100 microlitri ~. Valida il pΔGOI con enzima di restrizione digerisce per misurare le dimensioni del plasmide DNA e verificare il DNA pΔGOI atteso banding pattern. Finalizzare convalida di pΔGOI dal sequenziamento del DNA del 5 'e 3' fianchi rivolte genomici per verificare 100% sequenza di DNA sulla base dei dati di sequenza del genoma in http://www.ToxoDB.org . Nota: Vicino perfetta omologia di sequenza è essenziale per massimizzare gene targeting efficienza 3 in quanto ogni coppia base di differenza costituisce una corrispondente riduzione nella lunghezza della perfetta omologia. Nota: La sequenza del genoma del tipo II Δku80 sforzo in base al Pru genitori stpioggia non è disponibile in questo momento. Questo lavoro utilizza il tipo II ME49 sequenza del genoma come il genoma surrogato per la II Δ ceppo ku80 tipo. Sulla base di dati di sequenza in un numero di loci genetici, si stima che il ME49 genoma e il Pru genoma esibiscono polimorfismi a una frequenza di ~ 1 per 10.000 nucleotidi, o meno. Genera> 200 mcg di pΔGOI stock di inoculando un ~ 250 ml 2xYT + AMP cultura durante la notte con gli stock di glicerolo da un E. convalidato coli miniprep clone. PΔGOI isolare DNA plasmidico dal grande coltura usando un kit di isolamento del DNA maxiprep, risospensione in un volume finale di ~ 1.000 microlitri. Ripetere enzima di restrizione digerisce, o DNA sequenziamento del DNA maxiprep pΔGOI di verificare la corretta molecola di DNA di targeting prima della trasfezione. Linearizzare ~ 15 mcg pΔGOI all'estremità 5 'estremità usando l'enzima di restrizione unico X (RE.X)sito digest incorporato nella 5 'obiettivo di fianco (Figure 1B). Nota: gene targeting in T. gondii richiede un minimo di ~ 10 pg di DNA di targeting per ottenere un efficiente frequenza di eventi rivolti al locus del gene di interesse 2. Convalidare linearizzazione di pΔGOI e determinare la concentrazione di DNA mediante elettroforesi su gel di agarosio o un metodo alternativo. Nota: Se enzimi di restrizione al 5 'fianco non cede completa linearizzazione, il progettato 3' unico sito RE.Y digest può essere usato come un sito alternativo per la linearizzazione di pΔGOI. Nota: Una molecola di DNA di targeting completamente linearizzato è essenziale per il successo del gene targeting per ricombinazione omologa nelle ku80 ceppi Δ. Neutralizzare l'enzima di restrizione da incubatzione a 68 ° C per 15 – 20 min. Preparare almeno 15 microgrammi di plasmide linearizzato in 100 ml di sterile H 2 O. Conservare linearizzato pΔGOI a -20 ° C fino al momento della transfezione. 1.2 Preparazione di T. gondii parassiti, trasfezione, selezione, subcloning, validazione, archiviazione e mantenimento di ceppi geneticamente modificati Metodi generali per la cultura e la manipolazione di T. gondii nei fibroblasti del prepuzio (HFF), le cellule umane sono descritte 19-21. I Δ Δ ku80 hxgprt ceppi replicano normalmente in parassita infezione medio (Eagles Minimal Essential Medium (EMEM) terreno di crescita integrato con 1% di siero fetale bovino (FBS) e 1% contro funghi-antibiotico diluito da uno stock 100x) 1,2. Tutto il lavoro con Toxoplasma gondii deve essere effettuata utilizzando il livello di biosicurezza 2 procedure. Il T. gondii RHΔ ku80 2 pareceppo ntale è stata generata dal RHΔ hxgprt ceppo dal Roos Lab 14. Il PruΔku80 1 ceppo parentale è stata generata da PruΔhxgprt (Pru gniaud ceppo BSG-4 22) che contiene un marcatore selezionabile CAT integrato stabilmente e una proteina (GFP) reporter fluorescente verde sotto il controllo della fase bradyzoite LDH2 promotore specifico. Seminare una 2 tarato da 25 cm contenente cellule HFF confluenti con 1 x 10 6 praticabile tipo I RH Δ Δ ku80 hxgprt parassiti, o inoculare due 25 centimetri 2 flaconi con 2 x 10 6 praticabile tipo II Prugniaud (Pru) Δ Δ ku80 hxgprt parassiti. Nota: i parassiti vitali sono definiti come parassiti extracellulari che hanno appena lisati fuori. Nota: </strong> Questa scala fornisce un numero sufficiente di parassiti vitali per tre esperimenti di trasfezione. Ispezionare le colture infette Δ Δ ku80 hxgprt ~ 68-72 ore post-infezione. Verificare la presenza di parassiti vitali e ~ 90-95% lisi delle cellule HFF per pianificare la tempistica precisa di trasfezione. Nota: L'isolamento di parassiti appena egressed è essenziale per il successo di questo protocollo perché bassa vitalità parassita abolirà gene-targeting efficienza. Agitare parassiti vitali in soluzione chiudendo il coperchio plug-sigillo sul 2 tarato da 25 cm ed agitare vigorosamente il matraccio avanti e indietro per agitare i parassiti fino alla superficie di crescita senza spruzzi liquido sul lato interno del coperchio o il collo del pallone . Nota: Parasite raccolto non necessita di liberatoria protocollo siringa con ago per il tipo I oTIPO II Δ ku80 ceppi. Trasferire la soluzione parassita ad una siringa 10 attaccato ad un supporto del filtro contenente una membrana 3 micron e posizionare l'unità filtro su di un tubo aperto 15 ml con tappo a vite. Siringa filtrare i parassiti in 15 ml di tubo con tappo a vite. Nota: Filtro dei parassiti attraverso la membrana rimuove le cellule infette e detriti cellulari. Determinare la concentrazione parassita (forma di tachizoiti per ml) con un emocitometro. Nota: Opzionale: Utilizzando la soluzione parassita, ha istituito una unità di formazione di placca (PFU), saggio di 21 che verrà letto 7-8 giorni dopo per determinare un'adeguata redditività dei parassiti transfettate (PFU a tachizoite rapporto ≥ 0,2). Pellet parassiti per 7 min a 1400 xg e aspirare il surnatante a ~ 0,4 ml senza disturbare il parassita pellet. Spin per 2 min a 1,400 xg ed aspirare rimanente surnatante a ~ 0,01 ml senza disturbare il parassita pellet. Risospendere il pellet parassita da sfogliando il fondo della provetta e aggiungere immediatamente cytomix tampone 23 (1,33 x concentrazione) al parassita pellet per ottenere una concentrazione parassita di 4 – 5 x 10 7 parassiti / ml cytomix. Nota: omettere l'aggiunta di ATP e glutatione per cytomix da queste aggiunte non migliorano l'efficienza del gene targeting. Scongelare il 100 microlitri aliquota del linearizzato pΔGOI dal protocollo 1.1 (passo 26). Trasferire 0,3 ml della soluzione cytomix parassita (~ 1,3-1,6 x 10 7 parassiti) al 100 pl di linearizzata pΔGOI dal protocollo 1.1 (fase 26), e trasferire immediatamente l'intero 0,4 ml parassita + pΔGOI miscelato alla refrigerati gap di 2 mm elettroporazione cuvetta. Electroporate i parassiti a 1,4 kV e 24 Ω. Rest la cuvetta transfezione a temperatura ambiente per 5 min ~ quindi trasferire l'intero contenuto della cuvetta trasfezione in un pallone da 150 2 cm contenente cellule confluenti HFF con 30 ml di mezzo infezione e incubare la coltura overnight infetto. Inizio selezione in acido micofenolico + xantina (MPA + X) ~ 20 ore post-trasfezione (Figura 2A) sostituendo il mezzo infezione con MPA + X mezzo di selezione (MPA (25 mcg / ml) e xantina (50 mcg / ml) in medie infezione). Nota: Non disturbare il MPA incubazione + X pallone selezione. Stimare il numero totale di PFUs nel MPA + X beuta selezione ~ 8 giorni dopo la trasfezione controllando visivamente il monostrato. Verificare la presenza di zone di sviluppo PFUs e sani di infezione al microscopio ottico. Nota: se le placche non sono visibili di giorno 8, mantenere la selezione e il monitor per i segni di infettareione poiché ceppi mutanti possono avere una ridotta velocità di replicazione. Nota: I Δ Δ ku80 hxgprt parassita ceppi hanno una bassissima sfondo di eventi nontargeted indesiderati, che consente l'isolamento di successo di ceppi mutanti con abbastanza grave, ma i difetti di crescita non letali. Se un gene è essenziale e non può essere eliminato, la trasfezione primaria, o successivamente passò popolazione parassita, può rivelare un fenotipo in cui i parassiti cessano di replicare durante la selezione come la popolazione decide di ko mirati. Agitare il pallone come nel passaggio 3 per rimuovere i parassiti extracellulari dal monostrato [dopo placche visibili hanno sviluppato] per generare una soluzione parassita. Trasferimento ~ 0,5 ml della soluzione parassita dal MPA + X beuta selezione ad 25 cm 2 MPA + X beuta selezione contenente cellule confluenti (HFF designare questa cultura passaggio 1A). Sloggiare parassitas in originale 150 centimetri 2 MPA + X pallone selezione ~ 3 giorni dopo e il trasferimento ~ 0,5 ml soluzione parassita ad un secondo 25 centimetri 2 MPA + X pallone selezione contenente cellule HFF confluenti (designare questa cultura passaggio 1B). Consentire zone di infezione da sviluppare in passaggio 1A e / o passano fiaschi 1B per ~ 5 giorni. Verificare visivamente al microscopio ottico che passa 1A e 1B flaconi contengono un minimo di 25 PFUs vitali con le zone sane di infezione. Scegliere la 1A pass o pallone 1B pass per continuare il passaggio in MPA + X medie selezione in 25 centimetri 2 fiaschi. Mantenere passaggio sotto MPA + selezione X. Nota: I parassiti devono essere coltivate per un numero sufficiente di generazioni per cancellare episomi persistenti non integrati dalla popolazione prima subcloning. Non eseguire subcloning prima a 20 giorni dopo la trasfezione di tipo I RH Δ Δ ku80 hxgprt, o prima di 25 giorni dopo la trasfezione pertipo II Pru Δ Δ ku80 hxgprt parassiti per consentire un tempo sufficiente a diluire episomi non integrati 1,2. Parassiti subclone in un vassoio da 96 pozzetti contenenti cellule HFF confluenti con MPA + X medie selezione. Preparare un vassoio ad una concentrazione di 1 parassita / pozzetto ed un secondo vassoio ad una concentrazione di 2 parassiti / pozzetto. Nota: i parassiti subclone che sono recentemente lisate (~ 90 – 95% delle cellule HFF nel pallone 2 25 cm) per assicurare che i parassiti hanno alta vitalità. Nota: L'intervallo di tempo ottimale post-trasfezione per subclonaggio è stato istituito con la misura quanto rapidamente i parassiti mirati con successo nascono ad alta frequenza nella popolazione selezionata 1. Continuare a passare la popolazione primaria di parassiti trasfettati in MPA + medie selezione X usando un programma settimanale passaggio di infettareun matraccio HFF 25 cm 2 con 10 microlitri della soluzione parassita. Nota: se i cloni che trasportano il gene delezione mirata (ko) non sono ottenuti dalla prima subclonaggio nel passaggio 18, resubclone i parassiti da parte della popolazione in continuo mantenuto ~ 10 – 12 settimane dopo la trasfezione. Nota: Uno dei motivi di un gene delezione non è ottenuta nasce dalla persistenza episomale di alcuni plasmidi pΔGOI. Persistenza episomiale è determinata dalle sequenze contenute nel 5 'e al 3' genomiche fianchi di targeting e non sembra derivare dall'elemento genetico HXGPRT. Circa il 5 – 10% di plasmidi di targeting presentare una significativa persistenza episomale che necessita di un tempo dopo di subcloning di permettere alla popolazione parassita un numero di volte sufficiente di generazione per diluire le episomi persistenti e risolvere la popolazione di integrants principalmente stabili. <ol start = "20"> Punteggio ottenuto il 96 pozzetti vassoio 6-7 giorni dopo subcloning (tipo parassiti I) o 7-8 giorni dopo subcloning (parassiti di tipo II) per i pozzi che contengono un singolo PFU, identificata come una singola zona di infezione in microscopia ottica a o 40X o 60X potere. Segnare un puntino sul coperchio del vassoio 96 pozzetti per indicare la posizione del PFU nel pozzo. Mescolare il contenuto di ogni pozzetto contenenti un singolo PFU con una pipetta fissato a 50 pl (200 microlitri punta) da dirigere il flusso del fluido al di sopra del PFU per disperdere parassiti nel pozzo. Nota: Mescolando il bene accelera lisi parassita del monostrato HFF. Tipo I ceppi RH farò lisare il bene ~ 4 giorni dopo la miscelazione, di tipo II Pru parassiti saranno lisare il bene ~ 5 giorni dopo la miscelazione. Seleziona una dozzina lisati pozzi (cloni) e graffi nella parte inferiore di ciascuno di questi pozzi lisati utilizzando un 0,5-10 punta della pipetta ml e contemporaneamente di redazione 6 ml di soluzione di parassita. Transfer il 6 microlitri di soluzione parassita ad un pozzetto su una piastra a 24 pozzetti contenenti le cellule HFF confluenti in 1 ml MPA + X mezzo di selezione. Nota: è essenziale graffiare il fondo del bene per mantenere l'apertura foro della punta della pipetta in costante contatto con parassiti che risiedono sul fondo del pozzo. Monitorare il vassoio 24 pozzetti per la lisi delle cellule HFF. Nota: Il tipo I parassiti RH in genere la lisi del bene nel formato a 24 pozzetti in ~ 4 giorni. Tipo II Pru parassiti in genere la lisi del bene in ~ 5 giorni. Trasferire 2 ml di soluzione praticabile parassita graffiato dal fondo di ciascun pozzetto nel formato 24 pozzetti alla corrispondente pozzo di un nuovo vassoio 24 pozzetti contenenti cellule HFF confluenti e 1 ml MPA + X mezzo di selezione per pozzetto. Nota: Tutti i parassiti cloni e le linee possono essere continuamente principalecontenute passando 2 microlitri di soluzione praticabile parassita ogni 7 giorni in questo formato vassoio 24 pozzetti. Verificare che i parassiti sono stati trasferiti con successo in un nuovo vassoio 24 pozzetti di ispezione visiva con microscopio ottico ~ 18 ore dopo il passaggio. Parassiti raccolto dai pozzi lisati del vassoio 24 e dal punto 23-24 utilizzando sia un 1 ml o 10 ml pipetta e trasferire la soluzione parassita di una provetta Eppendorf. Pellet i parassiti a 1.400 x g per 7 minuti, lavare una volta in 1 ml di tampone fosfato (PBS), e pellet di nuovo a 1.400 x g per 3 min. Aspirare il PBS dal pellet, quindi aggiungere 200 microlitri di PBS al pellet per risospendere le parassiti. Congelare la soluzione parassita a -80 ° C fino isolamento del DNA. Isolare DNA parassita da ogni clone utilizzando un tessuto DNA isolamento minikit. Convalidare la delezione del gene targeting (knockout) mediante PCR utilizzando primer di validazione (figure 2A-C). Test per laassenza del funzionale regione codificante del gene di interesse e usando l'upstream e downstream CxF cxr primer di DNA genomico (figure 2A-B) Test per la presenza di prodotti di PCR che abbracciano i fianchi di targeting genomiche e HXGPRT dimostrare esatta 5 'e 3 'integrazione mirata del gene HXGPRT nel locus genico eliminato. Nota: Primer per la validazione deve essere unico per il gene di interesse o di un risultato falso positivo può essere ottenuto. Progettazione Primer può essere convalidato in http://www.toxodb.org facendo saltare sequenze primer per il genoma (s) per verificare primer sono unici. Passage cloni parassita su una pianificazione settimanale, come descritto al punto 24. Una volta che la delezione mirata è stato convalidato, continuando selezione nel MPA + X è facoltativo. Archivio parassita cloni preparando scorte congelatore. Pellet parassiti extracellularidalle cellule HFF lisate in un pallone di coltura 25 centimetri 2, rimuovere i supporti e delicatamente risospendere parassita pellet in coltura cellulare congelamento medio ad una concentrazione parassita> 4 x 10 7 parassiti per ml. Trasferire aliquote di cryovials e parassiti negozio indefinitamente in azoto liquido, oppure a -80 ° C. 2. Soppressione di HXGPRT Questo protocollo è progettato per rimuovere il marcatore HXGPRT dal suo sito di integrazione nel genoma di un Δ ku80 ceppo geneticamente manipolati. Rimozione di HXGPRT permette il recupero marcatore e la generazione di ceppi con molteplici manipolazioni genetiche utilizzando solo le selezioni a base di HXGPRT 1-3. Mentre il protocollo descritto di seguito descritto il metodo di riorientamento di un locus per eliminare HXGPRT, va notato che la rimozione del HXGPRT al locus del gene di interesse consente inoltre simultanea reintegrazione del gene wild-type (complementation), re-integrazione di un gene mutante, così come ri-integrazione di un gene tag (N-o C-terminale GFP, HA tag, ecc,), consentendo una varietà di manipolazioni genetiche. I meccanismi d'azione 24 e targeting protocolli mediante selezioni 6-thioxanthine sono stati precedentemente descritti 1-3,15. 2.1 Elimina HXGPRT Accise il marcatore selezionabile HXGPRT da pΔGOI da digerire con RE.Z per tagliare le uniche siti di enzimi di restrizione che fiancheggiano il HXGPRT (Figura 1B). Verifica completa digestione del DNA tramite elettroforesi su gel di agarosio. Isolare la più grande delle due bande di gel di agarosio. Nota: La più grande delle due bande contiene il plasmide con il 5 'e 3' del DNA bersaglio fianchi, ma non il gene HXGPRT. Posizionare la sezione di agarosio contenente la banda di DNA più grande in una layin colonna di sping il piatto gel sulla membrana. Centrifugare a 13.000 x g per 4 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere sterile H 2 O al flusso passante per portare il volume a 100 microlitri. Nota: Altri metodi commerciali sono disponibili per isolare il DNA da agarosio. Concentrare DNA da EtOH precipitazione, risospendere il DNA in un volume finale di 18 microlitri sterile H 2 O. Miscelare 1 ml di DNA concentrato con 7 ml di H 2 O, 1 microlitri di buffer legatura 10x e 1 microlitri DNA ligasi T4 (5 unità) e posizionare la reazione a 4 ° C per una notte per generare pΔGOIc (pΔGOIclean) (Figura 3A). Nota: frammenti di DNA con RE.Z contenenti estremità del DNA possono essere progettati e inclusi in questo passaggio per creare plasmidi adatti mirata re-integrazione del gene wild-type (complementazione), mirata re-integrazione di un gene mutante, nonché mirati re-integrazione di un gene con tag(N-o C-terminale GFP, HA tag, ecc). Diluire il 2x reazione con sterile H 2 O prima di elettroporazione. Trasforma pΔGOIc in E. coli come nel protocollo 1.1 a sottoclone, isolare, e convalidare il plasmide di mira. Poi linearizzare pΔGOIc in preparazione per trasfezione (vedere i passaggi 1.1.11 a 1.1.26). Ripetere il protocollo di trasfezione parassita come indicato nel protocollo 1.2 (punti da 1 a 11). Nota: Prima di svolgere i punti da 1 a 8, verificare che la rimozione mirata di HXGPRT è fattibile nel ceppo mutante. Infettare un pallone 2 150 centimetri di cellule HFF confluenti con 1 x 10 6 tachizoiti del ceppo mutante che utilizzano 6-thioxanthine (6TX) medio selezione (200 mcg / 6TX in media infezione ml) e posizionare il pallone in un saggio di PFU. Ispezionare il pallone otto giorni dopo per verificare che nessuno (o molto pochi; <10) PFU sono visibili, il che è essenziale stabilire che il potenzialegene ziale di targeting efficienza supererà qualsiasi potenziale reversione spontanea del ceppo mutante di un fenotipo con espressione HXGPRT ridotta (una resistenza fenotipo 6TX). Nota: Circa il 5 – 10% dei siti di integrazione HXGPRT presentano una frequenza significativa e spontanea di resistenza 6TX anche se il marcatore HXGPRT è ancora integrato nel sito di destinazione (vedere la sezione Risultati rappresentante per la spiegazione). Inizia selezione 6TX ~ 20 ore dopo la trasfezione, cambiando il medium nel 2 pallone da 150 cm a 6TX medie selezione. Nota: Non disturbare il pallone per ~ 10 giorni dopo la trasfezione. Ispezionare il pallone per la formazione di PFU al giorno 10 – 12 post-trasfezione (tipo I parassiti) o il giorno 10 – 16 post-trasfezione (parassiti di tipo II). Nota: ParasiTES essere mirati per la cancellazione di HXGPRT non cominceranno a crescere sotto selezione 6TX fino a quando il gene HXGPRT e mRNA viene eliminato, e la proteina HXGPRT residuo viene inattivato. Agitare il matraccio di selezione per creare una soluzione parassita, e trasferimento 0.5 – 1.0 ml della soluzione parassita ad un nuovo 2 tarato da 25 cm contenente cellule HFF confluenti e 5 ml 6TX mezzo di selezione. Ripetere il trasferimento dal primario 150 centimetri 2 a New 25 centimetri 2 boccette una volta al giorno per altri due giorni. Nota: un campionamento multiplo aumenta le probabilità di catturare parassiti mirati vitali che hanno perso il gene HXGPRT. Ispezionare la 25 centimetri 2 palloni ~ 5 giorni dopo l'infezione per verificare la presenza di sviluppare PFUs con zone di parassiti replicanti sani. Selezionare uno o due flaconi contenenti zone di infezione. Nota: </strong> Parassiti cancellati della replica gene HXGPRT ad un tasso di crescita normale in selezione 6TX. Continuare a passare i parassiti nelle 6TX medio selezione. Subclone la popolazione parassita dopo 25 – 30 giorni di selezione. Impostare un vassoio da 96 pozzetti con ~ 1 parassita / bene e un altro con ~ 2 parassiti / e. Preparare DNA parassita da cloni isolati e mantenere cloni in una cultura formato a 24 pozzetti secondo il protocollo 1.2 (misure 19-29). Convalida cancellazione di HXGPRT mediante PCR utilizzando la strategia delineata nelle figure 3A-B. 3. C-terminale Tagging delle Proteine Questo protocollo è progettato per C-terminale di codifica di proteine ​​di mira il tag per integrazione mediante doppia croce oltre ricombinazione omologa al locus genomico del gene utilizzando MPA + X selezione 2,4. Questo protocollo funziona efficiente perché la sequenza 5 'della DHFR <em> HXGPRT marcatore è un funzionale regione 3 'non tradotta completamente validato per altri geni 2,4. 3.1 diretto marcatura C-terminale delle proteine ​​a loci genetici endogeni Creare il targeting pΔGOItag costrutto plasmidico utilizzando lievito clonazione recombinational (Figura 4) e metodi descritti nel protocollo 1.1. Il 5 'genomica fianco di mira contiene gli ultimi 800 a 1200 bp della regione codificante (o DNA genomico) del GOI, tranne il codone di terminazione viene spostato in una posizione 3' al tag di scelta (HA tag, tag di Myc, la sua etichetta , ecc) Creare l'inserimento mirato del tag C-terminale al locus del gene endogeno codificanti proteine ​​seguendo la procedura descritta in protocollo 1.1 e 1.2 utilizzando la strategia delineata (Figura 4). Verificare l'inserimento del tag C-terminale al locus del gene endogeno utilizzando una strategia PCR. Reindirizza il locus genico utilizzando metodi descritti nel protocollo 1 e 2 del protocollo di dElete il marcatore selezionabile HXGPRT per creare un endogeno locus genico regolato con precisione che esprime una proteina marcata. Questo protocollo recupera anche il marcatore selezionabile HXGPRT che può essere utilizzato nuovamente per indirizzare un altro locus nel ceppo targhetta (vedi protocollo 1).