Manipulation génétique<em> Δku80</em> Les souches pour l'analyse génomique fonctionnelle de<em> Toxoplasma gondii</em

1. Gene Targeting pour supprimer un gène d'intérêt Ce protocole est conçu pour la génération efficace d'une souche mutante qui a une délétion du gène ciblé à un locus génétique défini. L'décrit précédemment T. gondii hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransférase (HXGPRT) marqueur de sélection est utilisé dans ce protocole pour l'insertion de marqueurs sûre et fiable à la suite de l'acide mycophénolique et la xanthine (MPA + X) Sélection 14-16. Ce protocole utilise une méthode validée et efficace pour construire des molécules d'ADN de ciblage basé sur la levure clonage par recombinaison 17,18. Plusieurs protocoles alternatifs sont disponibles dans le commerce pour construire des molécules ciblant recombinantes en utilisant des méthodes de clonage de recombinaison bactériennes, dans les méthodes de clonage de recombinaison in vitro ou fusion PCR. Le protocole décrit ci-dessous donne le rendement global le plus élevé et la fiabilité de la récupération cloné paragraphesites possédant une délétion du gène ciblé dans Δ Ku80 souches de T. gondii. 1.1 Préparation du ciblage de l'ADN Accès ToxoDB 6 ( http://www.toxodb.org ) pour obtenir des séquences génomiques du gène d'intérêt (GOI). Remarque: les séquences génomiques peuvent être obtenus auprès de type I, II ou III séquence du génome de la base de données ToxoDB qui est plus proche de la souche d'être manipulé. Par exemple: GT1 pour des RH et ME49 pour Pru. Conception chevauchement des amorces spécifiques qui amplifient la 5 'et 3' flancs ciblant génomiques du gène d'intérêt (GOI) incorporant un chevauchement 33 pb avec la navette de levure vecteur pRS416 (ou encore pRS426) et intégrer un chevauchement 33 pb avec le marqueur de sélection ( HXGPRT) (Figures 1A-B). Ajouter un site d'enzyme de restriction unique dans chaque amorce aux deux extrémités de la partie 5 'd'unflancs ciblant génomiques nd 3 ', placées entre le chevauchement 33 pb et le T. séquence de l'amorce gondii spécifique (s) (Figures 1A-B). Note: A plus de 30 chevauchement BP est nécessaire pour l'efficacité levure recombinaison clonage. Le 5 'et 3' des flancs de ciblage génomique sont conçus pour amplifier des fragments d'ADN spécifiques entre 800 et 1400 pb qui définissent une délétion ciblée. Soyez conscient que les flancs courts permettra de réduire considérablement l'efficacité du ciblage dans le Δ Δ Ku80 HXGPRT fond 2. Amplifier par PCR la région 5 'flanc cible en utilisant des amorces F1 et R1, et amplifier par PCR la région 3' flanc de la cible en utilisant une amorce et R2 F2 (figures 1A-C) à partir de l'ADN génomique 3. Séparément, amplifier par PCR le gène 2 kpb ~ HXPGRT dont l'associé en 5 'et 3' dhfr régions du HXGPRT cassette de pminiHXGPRT 14 ADNc en utilisant des amorces flanquant HXF et HXR(Figures 1B-C). Remarque: Amplification flancs cibles en utilisant l'ADN génomique de la souche parentale à transfecter. Remarque: Placez le marqueur HXGPRT dans l'orientation vers l'avant par rapport à la 5 'et 3' ADN de ciblage flancs pour faciliter les manipulations génétiques efficaces ultérieures, telles que la suppression ciblée de HXGPRT du locus perturbé. Vérifier les tailles des produits de PCR correctes par électrophorèse sur gel d'agarose et d'estimer la concentration de fragments d'ADN sur gel d'agarose en utilisant des normes ou à un autre procédé de détermination de la concentration d'ADN. Générer des portions de levure compétentes telles que décrites dans Gietz et Schiestly 17. Moissonneuse 50 ng de 5 'flanc ciblage génomique, 50 ng de 3' flanc ciblage génomique, 100 ng de marqueur de sélection HXGPRT, et 50 ng de vecteur navette linéarisé avec H 2 O stérile pour obtenir un volume final de 10 -20 pl. Transformez levure compétente avec les trois produits de PCR et la levure E. vecteur navette coli pour le clonage par recombinaison selon le protocole décrit par Gietz et Schiestly 17. Plate transformé levure sur gélose de milieu minimal uracile moins et incuber à 30 ° C pendant 2 – 3 jours. Remarque: L'ensemble ordonné de le plasmide, 5 'flanc cible, le marqueur HXGPRT et 3' flanc cible est facilitée par les 33 chevauchement des pb d'ingénierie entre les fragments d'ADN (Figures 1A-B) et est médiée par recombinaison homologue dans levure. levure de récolte en ajoutant 2 ml de 2x YPAD aux plaques uracile moins et en grattant doucement pour déloger les colonies sans perturber l'agar-agar. Centrifuger la solution de levure pendant 5 min à 5000 xg et jeter le surnageant. Reprendre la levure culot dans 250 ul d'un tampon de remise en suspension contenant RNaseA et ajouter 50 – 100 pi d'uneperles de verre cid à ​​la chaux à la solution. Vortex pendant 5 min à la vitesse la plus élevée pour briser les cellules de levure. Permettre aux billes de verre de se déposer au fond du tube et de transférer le surnageant dans un tube Eppendorf de 2 ml. Isoler l'ADN de levure en utilisant un kit d'isolation d'ADN miniprep, remise en suspension dans un volume final de 100 pl ~. Mélanger 2 pl ADN de levure (~ 50 ng) avec 40 pl de DH10B électroporation compétente E. coli conservés dans la glace. Transférer la solution dans une réfrigéré 2 mm écart cuvette d'électroporation et l'électroporation des cellules bactériennes à 2,4 kV et 129 Ω. cellules de sauvetage en ajoutant 0,8 ml de bouillon SOC à chaque cuvette et une solution de transfert dans un tube Falcon à bouchon 14 ml. Incuber les cellules à 37 ° C sur un tambour de rouleau de 40 – 60 min. Plate E. coli sur 2XYT + ampicilline plaques (AMP) et incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit. Choisissez ~ 6 – 8 colonies isolées et de grandir dans 3 ml 2XYT + AMP pour ~ 16 heures à 37 ° C. <li> Préparer un bouillon de glycérol congélateur de 30% de chaque E. clone coli. Isoler pΔGOI plasmide de E. clones de E. coli en utilisant un kit miniprep, remise en suspension dans un volume final de 100 pl ~. Valider la pΔGOI en utilisant l'enzyme de restriction digère pour mesurer la taille du plasmide d'ADN et vérifier l'ADN pΔGOI attendu profils de bandes. Finaliser la validation de pΔGOI par séquençage de l'ADN 5 'et 3' ciblant les flancs génomiques pour vérifier séquence d'ADN de 100% sur la base des données de séquences génomiques dans http://www.ToxoDB.org . Remarque: environs parfaite homologie de séquence est essentiel pour optimiser l'efficacité de ciblage de gène 3 depuis chaque différence de paire de base constitue une découpe correspondante de la longueur de l'homologie parfaite. Note: La séquence du génome de la souche de type II Δku80 basé sur le Pru parental stpluie n'est pas disponible en ce moment. Ce travail utilise la séquence de type II ME49 du génome que le génome de substitution pour la souche de type II Δ Ku80. Basé sur des données de séquence à un certain nombre de loci génétiques, on estime que le génome ME49 et le génome Pru présentent polymorphismes nucléotidiques simples à une fréquence de ~ 1 pour 10.000 nucléotides ou moins. Générer> 200 pg de stock pΔGOI en inoculant une ~ 250 ml 2XYT + AMP culture de la nuit avec des stocks de glycérol à partir d'un E. validé coli miniprep clone. Isoler l'ADN plasmidique pΔGOI de la grande culture en utilisant un kit d'isolation d'ADN maxiprep, remise en suspension dans un volume final de ~ 1000 ul. Répéter enzyme de restriction digère, ou le séquençage d'ADN de l'ADN maxiprep pΔGOI pour vérifier la molécule d'ADN de ciblage correcte avant la transfection. Linéariser ~ 15 pg pΔGOI à l'extrémité 5 'en utilisant l'enzyme de restriction unique X (RE.X)Site digest construit en 5 'flanc cible (figures 1B). Note: Le ciblage génique en T. gondii nécessite un minimum d'environ 10 ug d'ADN de ciblage afin d'obtenir une fréquence efficace de cibler un événement dans le locus du gène d'intérêt 2. Valider linéarisation de pΔGOI et déterminer la concentration d'ADN par électrophorèse sur gel d'agarose ou une autre méthode. Note: Si la restriction digestion enzymatique à l'extrémité 5 'flanc ne donne pas linéarisation terminée, le 3 conçu «le site digest RE.Y unique peut être utilisé comme un site alternatif pour la linéarisation de pΔGOI. Note: Une molécule d'ADN de ciblage complètement linéarisé est essentielle pour génique efficace de ciblage par recombinaison homologue dans les souches Ku80 Δ. Neutraliser l'enzyme de restriction par Incubattion à 68 ° C pendant 15 – 20 min. Préparer au moins 15 ug de plasmide linéarisé dans 100 pi de stériles H 2 O. Magasin linéarisé pΔGOI à -20 ° C jusqu'au moment de la transfection. 1.2 Préparation de T. parasites Toxoplasma, la transfection, la sélection, sous-clonage, la validation, l'archivage et l'entretien des souches génétiquement modifiées Méthodes générales pour la culture et la manipulation de T. gondii dans les cellules de fibroblastes de prépuce humain (HFF) sont décrits 19-21. Les souches Δ Δ Ku80 HXGPRT reproduisent normalement en milieu d'infection parasite (Eagles Minimal Essential Medium (EMEM) de milieu de culture supplémenté avec 1% de sérum de veau fœtal (FBS) et 1% dilué dans un stock 100x antimycosique-antibiotique) 1,2. Tout le travail avec Toxoplasma gondii doit être effectuée à l'aide du niveau de biosécurité 2 procédures. Le T. gondii RHΔ Ku80 2 PareNTAL souche a été générée à partir de la souche RHΔ HXGPRT du Roos Lab 14. Le PruΔku80 une souche parentale été générée à partir PruΔhxgprt (souche gniaud Pru BSG-4 22) qui contient un marqueur sélectionnable CAT intégré de façon stable et d'une protéine fluorescente (GFP) journaliste verte sous la commande de l'étage de LDH2 promoteur spécifique bradyzoite. Inoculer un flacon de 25 cm2 contenant des cellules HFF confluentes avec 1 x 10 6 RH Δ Ku80 Δ HXGPRT parasites de type viable I, ou inoculer deux flacons de 25 cm2 avec 2 x 10 6 viable II Prugniaud Type (Pru) Δ Ku80 Δ HXGPRT des parasites. Note: parasites viables sont définies comme des parasites extracellulaires qui ont fraîchement lysées out. Remarque: </strong> Cette échelle fournit un nombre suffisant de parasites viables pour les trois expériences de transfection. Inspecter les cultures infectées Δ Δ Ku80 HXGPRT ~ 68 à 72 heures après l'infection. Vérifiez la présence de parasites viables et ~ 90 – 95% de lyse des cellules HFF à planifier le calendrier précis de la transfection. Note: L'isolement des parasites fraîchement sortis de l'avion est essentiel pour le succès de ce protocole parce que la faible viabilité du parasite abolira gène-efficacité du ciblage. Agiter parasites viables dans la solution en fermant le couvercle plug-joint sur ​​le flacon de 25 cm2 et agiter vigoureusement le flacon avant et en arrière pour agiter les parasites hors de la surface de croissance sans éclaboussures liquide sur l'intérieur du couvercle ou le col du flacon . Note: Parasite récolte ne nécessite pas un protocole de libération seringue-aiguille pour le type I outaper Ku80 souches Δ II. Transvaser la solution parasite à une seringue 10 fixée à un porte-filtre contenant une membrane de 3 pm et placer l'unité de filtre au-dessus d'un tube à vis de 15 ml bouchon ouvert. Filtrer les parasites seringue dans le tube à vis du bouchon 15 ml. Note: Le filtrage des parasites à travers la membrane élimine les cellules infectées et les débris cellulaires. Déterminer la concentration parasite (formes tachyzoïte par ml) en utilisant un hématimètre. Note: En option: Utilisation de la solution de parasite, mis en place une unité de formation de plaques (UFP) de dosage 21 qui sera lu 7 – 8 jours plus tard pour déterminer la viabilité adéquate des parasites transfectées (PFU à tachyzoïte ratio ≥ 0,2). Pellet parasites pendant 7 min à 1400 xg et recueillir le surnageant à ~ 0,4 ml sans perturber le culot parasite. Faites tourner pendant 2 min à 1,400 XG et aspirer surnageant restant à ~ 0,01 ml sans perturber le culot parasite. Reprendre le culot parasitaire en effleurant le fond du tube 23 et ajouter immédiatement tampon de CYTOMIX (1.33x concentration) pour le parasite pastille pour obtenir une concentration parasitaire de 4 – 5 x 10 7 / ml CYTOMIX parasites. NB: Omettre l'ajout d'ATP et de glutathion à CYTOMIX depuis ces ajouts ne s'améliorent pas l'efficacité du ciblage de gène. Décongeler les 100 aliquote de l'linéarisé pΔGOI du protocole 1.1 (étape 26). Transférer 0,3 ml de la solution de CYTOMIX parasite (~ 1,3 – 1,6 x 10 7 parasites) au 100 ul de linéarisé pΔGOI du protocole 1.1 (étape 26), et transférer immédiatement la totalité 0,4 ml parasite + pΔGOI mélange à une réfrigéré écart de 2 mm cuvette d'électroporation. Électroporer les parasites à 1,4 kV et 24 Ω. Rest la cuvette de transfection à la température ambiante pendant environ 5 min puis transférer la totalité du contenu de la cuvette de transfection dans un flacon de 150 cm 2 contenant des cellules HFF confluentes avec 30 milieu d'infection ml et incuber la culture infectée pendant la nuit. Début sélection dans l'acide mycophénolique + xanthine (MPA + X) ~ 20 heures après la transfection (figure 2A) en remplaçant le milieu de l'infection par le MPA + X milieu de sélection (MPA (25 pg / ml) et de la xanthine (50 pg / ml) dans moyen infection). Note: Ne pas déranger le MPA incubation + X ballon de sélection. Estimer le nombre total de PFU dans la MPA + X flacon de sélection ~ 8 jours post-transfection en inspectant visuellement la monocouche. Vérifier la présence de développer les zones UFP et sain de l'infection par microscopie optique. Remarque: Si les plaques ne sont pas visibles par jour 8, maintenir la sélection et surveiller les signes de contaminerions depuis souches mutantes peuvent avoir un taux de réplication réduit. Note: Les souches Δ Δ Ku80 HXGPRT parasites ont un très faible bruit de fond des événements indésirables non ciblés, ce qui permet un isolement réussi de souches mutantes avec assez sévère, mais des défauts de croissance non létales. Si un gène est essentiel et il ne peut pas être supprimé, la transfection primaire, ou par la suite passé population de parasite, peut révéler un phénotype où les parasites cessent de se multiplier pendant la sélection que la population décide de KO ciblées. Agiter le flacon comme à l'étape 3 pour déloger les parasites extracellulaires de la monocouche [après plaques visibles ont développé] pour générer une solution parasite. Transfert ~ 0,5 ml de la solution parasite de l'AMP + X sélection flacon de 25 cm2 une AMP + X ballon de sélection contenant cellules HFF confluentes (désigner cette culture passe 1A). Déloger parasites dans l'original de 150 cm 2 MPA + X sélection flacon ~ 3 jours plus tard et le transfert ~ 0,5 ml de solution parasite à un second 25 cm 2 MPA + X flacon de sélection contenant des cellules HFF confluentes (désigner cette culture passe 1B). Permettre aux zones d'infection de se développer dans passe 1A et / ou passent flacons 1B pendant environ 5 jours. Vérifier visuellement par microscopie optique qui 1A de passe et flacons 1B contiennent un minimum de 25 UFP viables avec des zones saines de l'infection. Choisissez soit le 1A de passe ou flacon 1B de passage pour le passage continu en + X milieu de sélection AMP en flacons de 25 cm2. Maintenir passage sous MPA + X sélection. Note: Les parasites doivent être cultivées pour un certain nombre de générations suffisant pour supprimer qu'épisomes persistantes non intégrés de la population avant le sous-clonage. Ne pas effectuer le sous-clonage avant 20 jours post-transfection de type I RH Δ Δ Ku80 HXGPRT, ou avant 25 jours post-transfection pourII Pru Δ Δ Ku80 HXGPRT parasites de type prévoir un délai suffisant pour diluer qu'épisomes non intégrés 1,2. parasites du sous-clone dans un plateau de 96 puits contenant des cellules HFF confluentes avec + X milieu de sélection AMP. Préparer un plateau à une concentration de 1 parasite / puits et un second plateau à une concentration de 2 parasites / puits. Note: les parasites du clone qui ont récemment lysées (~ 90 – 95% des cellules HFF dans le flacon de 25 cm2) de veiller à ce que les parasites ont une viabilité élevée. Note: Le délai optimal post-transfection pour le sous-clonage a été établi en mesurant la rapidité avec laquelle les parasites ciblés avec succès surviennent à une fréquence élevée dans la population sélectionnée 1. Continuer au passage la population principale de parasites transfectées dans un milieu de sélection + MPA X en utilisant un calendrier de passage hebdomadaire d'infecterun cm 2 HFF flacon de 25 à 10 pi de la solution de parasite. Remarque: Si clones portant la délétion du gène ciblé (KO) ne sont pas obtenus à partir de la première sous-clonage dans l'étape 18, resubclone les parasites de la population maintenue en permanence, ~ 10 – 12 semaines après la transfection. Note: Une des raisons pour lesquelles une délétion du gène n'est pas obtenu découle de la persistance épisomal de certains plasmides pΔGOI. Persistance épisomal est déterminée par les séquences contenues dans la 5 'et 3' ciblant les flancs génomiques et ne semble pas provenir de l'élément génétique HXGPRT. Environ 5 à 10% des plasmides ciblant présentent persistance épisomal importante qui nécessite un temps plus tard de sous-clonage pour permettre à la population parasite un nombre suffisant de temps de génération de diluer les qu'épisomes persistantes et résoudre la population à intégrants essentiellement stables. <ol start = "20"> Score du 96 puits plateau 6 – 7 jours post-sous-clonage (parasites de type I) ou 7-8 jours après sous-clonage (parasites de type II) pour les puits qui contiennent un seul PFU, identifié comme une zone unique de l'infection dans la microscopie optique à soit 40X ou 60X puissance. Marquer un petit point sur le couvercle du bac à 96 puits à désigner l'emplacement de la PFU dans le puits. Mélanger le contenu de chaque puits contenant un seul PFU en utilisant une pipette fixé à 50 l (200 pointe ul) en dirigeant l'écoulement de fluide au cours de la PFU pour disperser les parasites dans le puits. Note: Le mélange du bien accélère la lyse du parasite de la monocouche HFF. Type I souches RH lysera le bien ~ 4 jours après le mélange, II Pru parasites de type lyseront le bien ~ 5 jours après le mélange. Sélectionnez une douzaine lysées puits (clones) et zéro au bas de chacun de ces puits lysées en utilisant un 0,5-10 pipette ul tandis que simultanément dessin-up 6 pi de solution parasite. Transfer le 6 pi de solution parasite à un puits dans un plateau de 24 puits contenant des cellules HFF confluentes dans 1 ml MPA + X de milieu de sélection. Note: Il est essentiel de se gratter le fond du puits pour maintenir l'ouverture portait sur ​​la pointe de la pipette en contact constant avec les parasites qui résident au fond du puits. Surveiller le plateau de 24 puits pour la lyse des cellules HFF. Remarque: le type I parasites RH sera généralement lyse le bien dans le format de 24 puits dans ~ 4 jours. Type II Pru parasites seront généralement lyse bien dans ~ 5 jours. Transfert 2 ul de solution viable parasite rayé du fond de chaque puits dans le format à 24 puits pour le puits correspondant d'un nouveau plateau de 24 puits contenant des cellules HFF confluentes et 1 ml d'AMP + X milieu de sélection par puits. Note: Tous les parasites clones et les lignes peuvent être continuellement principalecontenues en passant 2 pl de solution de parasite viable tous les 7 jours dans ce format de plateau de 24 puits. Vérifiez que les parasites ont été transférés avec succès à un nouveau plateau de 24 puits par inspection visuelle avec la microscopie optique environ 18 heures post-passage. parasites de récolte des puits lysées du plateau de 24 puits de l'étape 23 – 24 en utilisant soit un 1 ml ou 10 ml pipette et transférer la solution parasite dans un tube Eppendorf. Pellet les parasites à 1400 x g pendant 7 minutes, rincer une fois dans 1 ml de tampon phosphate salin (PBS), et à granulés de nouveau à 1400 x g pendant 3 min. Aspirer PBS à partir du culot, puis ajouter 200 l de PBS dans le culot de remettre en suspension les parasites. Congeler la solution parasite à -80 ° C jusqu'au moment de l'isolement de l'ADN. Isoler l'ADN du parasite à partir de chaque clone en utilisant un isolement MINIKIT ADN des tissus. Valider la suppression du gène ciblé (KO) par PCR utilisant des amorces de validation (Figures 2A-C). Test de l'l'absence de la région codante fonctionnelle du gène d'intérêt et en utilisant le CxF amont et des amorces d'ADN génomique CxR aval (figures 2A-B) test de la présence de produits de PCR qui couvrent les flancs de ciblage génomique et HXGPRT de démontrer correcte en 5 'et 3 intégration du gène HXGPRT 'ciblée dans le locus du gène supprimé. Note: Les amorces pour la validation doivent être uniques au gène d'intérêt ou un faux résultat positif peut être obtenu. conception d'amorce peut être validé sur http://www.toxodb.org par projection des séquences d'amorces dans le génome (s) pour vérifier les amorces sont uniques. Passage clones de parasites sur un horaire hebdomadaire comme décrit dans l'étape 24. Une fois la suppression ciblée a été validé, la sélection continue dans MPA + X est facultative. Archive parasite clones en préparant des stocks de congélation. Pellet parasites extracellulairesà partir de cellules HFF lysées dans un cm 2 flacon de culture 25, retirer le support et doucement resuspendre culot parasitaire dans un milieu de congélation de la culture cellulaire à une concentration parasitaire> 4 x 10 7 parasites par ml. Transfert portions de cryovials et les parasites des magasins indéfiniment dans l'azote liquide, ou à -80 ° C. 2. Suppression de HXGPRT Ce protocole est conçu pour éliminer le marqueur HXGPRT de son site d'intégration dans le génome d'une souche génétiquement modifiée Δ Ku80. Suppression des HXGPRT permet la récupération de marqueur et la génération de souches multiples manipulations génétiques en utilisant uniquement des sélections basées sur HXGPRT 1-3. Alors que le protocole détaillé ci-dessous décrit la méthode de re-cibler un locus de supprimer HXGPRT, il convient de noter que la suppression de HXGPRT au niveau du locus du gène d'intérêt permet aussi simultanément re-intégration du gène de type sauvage (complementation), ré-intégration d'un gène mutant, ainsi que la réintégration d'un gène marqué (N-ou C-terminale de la GFP, HA étiquette, etc), ce qui permet une variété de manipulations génétiques. Les mécanismes d'action et ciblant 24 protocoles utilisant sélections de 6 thioxanthine ont été décrits précédemment 1-3,15. 2.1 Supprimer HXGPRT Accise le marqueur de sélection HXGPRT de pΔGOI par digestion avec RE.Z de couper dans les sites d'enzymes de restriction uniques flanquant le HXGPRT (figure 1B). Vérifier la digestion complète de l'ADN par électrophorèse sur gel d'agarose. Isoler le plus grand des deux bandes à partir du gel d'agarose. Remarque: le plus grand des deux bandes contient le plasmide avec le 5 'et 3' des flancs de cibles d'ADN, mais pas le gène HXGPRT. Placez la section agarose contenant la bande d'ADN plus grand dans une colonne layin de sping Le plat de gel sur la membrane. Faites tourner la colonne à 13000 x g pendant 4 min à température ambiante. Ajouter stériles H 2 O à la accréditives pour porter le volume à 100 pi. Remarque: D'autres méthodes commerciales sont disponibles pour isoler l'ADN à partir d'agarose. Concentrer l'ADN par précipitation par EtOH, la remise en suspension de l'ADN dans un volume final de 18 ul stériles H 2 O. Mélanger 1 pl de l'ADN concentré avec 7 ml H 2 O, 1 pl de tampon de ligature 10x et 1 pl de l'ADN ligase T4 (5 unités) et placez la réaction à 4 ° C pendant la nuit pour générer pΔGOIc (pΔGOIclean) (figure 3A). Note: fragments d'ADN avec RE.Z contenant des extrémités d'ADN peuvent être conçus et inclus à cette étape pour créer plasmides appropriés pour ré-intégration ciblée du gène de type sauvage (complémentation), re-intégration d'un gène mutant ciblé ainsi que ciblée réintégration d'un gène marqué(N-ou C-terminale de la GFP, HA étiquette, etc.) Diluer le 2x réaction avec H 2 O stérile avant électroporation. Transformez pΔGOIc dans E. coli que dans le protocole 1.1 pour clone, d'isoler et de valider le plasmide ciblage. Puis linéariser pΔGOIc en préparation pour la transfection (voir les étapes 1.1.11 à 1.1.26). Répétez le protocole de transfection parasite tel que décrit dans le protocole 1.2 (étapes 1 à 11). Note: Avant d'effectuer les étapes 1 à 8, vérifier que la suppression ciblée de HXGPRT est faisable dans la souche mutante. Infecter un cm 2 flacon de cellules HFF confluentes 150 à 1 x 10 6 tachyzoïtes de la souche mutante à l'aide de 6 thioxanthine (6TX) du milieu de sélection (200 ug / 6TX en milieu d'infection ml) et placer le ballon dans un essai PFU. Inspecter le flacon 8 jours plus tard pour vérifier qu'aucun (ou très peu; <10) PFU sont visibles, ce qui est essentiel pour établir que le potentielgène tiel ciblage efficacité va dépasser une réversion spontanée potentiel de la souche mutante d'un phénotype à l'expression de HXGPRT réduite (un phénotype de résistance 6TX). Note: Environ 5 – 10% des sites d'intégration HXGPRT présentent une fréquence significative et spontanée de résistance 6TX même si le marqueur HXGPRT est toujours intégré au site ciblé (voir la section Résultats de représentant pour l'explication). Début sélection 6TX ~ 20 heures après la transfection en changeant le milieu dans le flacon de 150 cm 2 de milieu de sélection 6TX. Note: Ne pas déranger le ballon pendant ~ 10 jours post-transfection. Inspectez le ballon pour la formation PFU à jour 10 – 12 post-transfection (parasites de type I) ou le jour 10 – 16 post-transfection (parasites de type II). Note: ParasiTES être ciblés pour la suppression de HXGPRT vont pas commencer à croître sous sélection 6TX jusqu'à ce que le gène HXGPRT et l'ARNm sont supprimées, et la protéine de HXGPRT résiduelle est inactivée. Agiter le flacon de sélection pour créer une solution parasite, et le transfert de 0,5 à 1,0 ml de la solution parasite à un nouveau flacon de 25 cm2 contenant des cellules HFF confluentes et 5 moyennes de sélection 6TX ml. Répétez le transfert des primaires 150 cm 2 de nouveaux flacons de 25 cm2 une fois par jour pendant deux jours de plus. Note: L'échantillonnage multiple augmente les chances de capture de parasites ciblés viables qui ont perdu le gène HXGPRT. Inspecter les 25 cm 2 flacons ~ 5 jours après l'infection de vérifier la présence de développer PFU avec des zones de parasites réplication sains. Choisissez une ou deux flacons contenant des zones d'infection. Remarque: </strong> Parasites supprimés de la réplication des gènes HXGPRT à un taux de croissance normal en sélection 6TX. Continuer au passage les parasites dans un milieu de sélection 6TX. Sous-cloner la population parasitaire après le 25 – 30 jours de sélection. Mettre en place un plateau de 96 puits avec ~ 1 parasite / puits et une autre avec 2 ~ parasites / puits. Préparer l'ADN du parasite à partir de clones isolés et de maintenir des clones dans une culture en format 24 puits selon le protocole 1.2 (étapes 19 à 29). Valider la suppression de HXGPRT par PCR en utilisant la stratégie décrite dans les figures 3A-B. 3. Tagging C-terminal des protéines Ce protocole est conçu pour C-terminal de marquage des protéines en ciblant le tag pour l'intégration par double croix sur la recombinaison homologue au locus génomique du gène à l'aide MPA + X 2,4 sélection. Ce protocole fonctionne de manière efficace parce que la séquence 5 'dhfr de l' <em> HXGPRT marqueur est fonctionnel une région 3 'non traduite entièrement validé pour d'autres gènes 2,4. 3.1 le marquage direct C-terminale des protéines à des loci génétiques endogènes Créer ciblage pΔGOItag construction plasmidique en utilisant des levures clonage par recombinaison (figure 4) et les méthodes décrites dans le protocole 1.1. Le 5 'flanc ciblage génomique contient les 800 à 1.200 dernières pb de la région codante (ou ADN génomique) du RBE, à l'exception du codon de terminaison est déplacé vers une position 3' de la balise de choix (HA, étiquette Myc, His , etc) Création de l'insertion ciblée de l'étiquette C-terminale au niveau du locus du gène endogène codant pour la protéine en suivant la procédure décrite dans le protocole 1.1 et 1.2 en utilisant la stratégie décrite (figure 4). Vérifier l'insertion de la balise C-terminale au niveau du locus du gène endogène à l'aide d'une stratégie PCR. Recibler le locus du gène utilisant les méthodes décrites dans les protocoles 1 et 2 à Delete le marqueur sélectionnable HXGPRT pour créer un locus de gène endogène régulé précisément qui exprime une protéine marquée. Ce protocole récupère également le marqueur de sélection HXGPRT qui peut être utilisé à nouveau pour un autre locus cible dans la souche marqué (voir protocole 1).