ホルマリン固定からプロテオミクスサンプル調製およびパラフィン包埋組織

1。計装必須マイクロダイセクションとサンプル溶解のための組織切片の作製サーモブロック99℃以下沸騰水と一緒にお風呂に設定。 レーザ動作microdissector（例えばヤシ、ツァイス、ゲッティンゲン、ドイツ）。 温度自動調節ベンチトップ遠心分離機、温度は20℃に設定エッペンドルフ型処分チューブ用ラックで濡れ室（箱）。 37℃に設定したインキュベーターマイクロスケール石英キュベット（0.1〜0.2ミリリットル）で近紫外光励起された蛍光の測定を可能にする蛍光光度計。 2。ソリューション 「組織溶解緩衝液」（TLB）：0.1 Mトリス-HCl、pH8.0、0.1 M DTT、0.5％（w / v）のポリエチレングリコール20,000、4％SDSである。 UA液：0.1Mのトリス-HCl、8.5での8 M尿素。 1サンプル当たり1ミリリットルを準備します。 UAおよびIAA溶液は新たに調製日以内に使用しなければならない。 IAAソリューション：0.05 M IUAにodoacetamide。 1サンプルあたり0.1ミリリットルを用意します。 エンドプロテアーゼのLys-Cの原液。 トリプシン、保存溶液。 「消化緩衝液」（DB）：0.05 Mトリス-HCl、8.5。 1サンプルあたり0.25ミリリットルを用意します。 「トリプトファン標準ソリューション '：1ミリリットル脱イオン水に0.1μgのトリプトファン。 「アッセイ緩​​衝液B '（ABB）：10mMトリス-HCl、pHは7.6。 ブリットン·ロビンソン広域緩衝液（BRUB）の原液。 0.1 M CH 3 COOH、0.1 MH 3 PO 4、及び0.1 MH 3 BO 3を含有する溶液を調製し、必要なpHを1M NaOHで調整し、（2、4、5、6、および11）。使用前に脱イオン水で5倍に希釈する。 脱イオン水中に1％（v / v）のCH 3 COOH：緩衝液。 緩衝液B：脱イオン水60％（v / v）のCH 3 CN、1％（v / v）のCH3COOH。 3。ピペットチップと 'StageTip'列共同でEMPOREアニオン膜の6層を積層して、SAXチップ·カラムを準備MMON 0.2ミリリットルピペットチップ。サンプルあたり2 SAXチップの列を作る。 0.2ミリリットルピペットチップでEMPORE-C 18の3層を積層して「StageTip」を準備します。各サンプルの6段階のヒントを作る。 4。マイクロダイセクションのための組織切片の調製とサンプル溶解ミクロトームでセクションをカット（スライスの厚さはサンプルによって異なります。通常マイクロダイセクションは、7月10日程度のスライスとよく動作します）。 45分間のUV光で膜スライド（MembraneSlide 1.0 PEN）を照射します。 2時間37℃で照射した膜スライドや乾燥のセクションをマウントします。 2.5分、1.5分、キシレン中で2連続したインキュベーションによってマウントされたセクションを脱パラフィン。連続した無水エタノールでインキュベーションし、70％エタノール、および水、1分間ずつ切片を再水和。 、20秒間、マイヤーのヘマトキシリン​​を持つセクションを染色1分、空気乾燥、水で洗い流してください。 細胞を収集populatiレーザーキャプチャーマイクロダイセクションシステムを用いて、目的の上で。 PALM装置（Zeiss）を使用する場合は、接着剤のキャップ内のサンプル（接着剤キャップ200）を収集。 キャップ内のマイクロダイセクション材料の上に、TLBの分量をピペット。チューブを閉じて、短い遠心分離によりサスペンションを収集します。溶解1時間攪拌しながら加熱ブロック中で99℃での顕微解剖した組織（600回転）。マイクロダイセクション組織の10 NLのためのバッファの3μlを使用する。 10分間18℃で16,000×gでの遠心分離により粗抽出物を明確にする。溶解物を-20℃で凍結保存することができる 5。試料処理液10μl未満がフィルターに残るまで、200限外濾過単位でのUAの液（法医学30K）および14,000×gで遠心分離して明確に溶解液を50μlまで混ぜる。通常、このステップでは、10〜15分の遠心分離を必要とします。 限外濾過ユニットにUAの200μlのピペットおよび5.1のように遠心分離します。コレクションチューブを空にします。 ピペット50 IAA溶液をμLおよび5.1のように、1分遠心のためのサーモミキサーで600rpmで混合します。 5.1のように限外濾過ユニットと遠心分離機にUA100μlのピペット。二回、この手順を繰り返します 5.1での限外濾過装置や遠心分離機にDBを100μLを加える。二回、この手順を繰り返します。 新しいコレクションチューブに濾過ユニットを転送します。ピペット40μL、DBエンドプロテアーゼのLys-C（1:100の総タンパク質比プロテイナーゼ）で、1分間サーモミキサーで600rpmで混合します。 18時間37℃で湿ったチャンバ内でユニットをインキュベートする。 このような5.1のように、14,000×gでフィルタユニットを遠心分離する。 5.1のように、脱イオン水、遠心フィルターユニットのピペット160μL。プールされたフロースルー（5.7および5.8のステップは）エンドプロテイナーゼLysのCでリリースされたペプチドが含まれています新しいコレクションチューブに限外濾過ユニットを転送します。 40μLを追加トリプシンでのDB（タンパク質比1:100酵素）と1分間サーモミキサーで600rpmで混合します。 4時間37℃で湿ったチャンバ内でユニットをインキュベートする。繰り返しますトリプシンペプチドを収集するために5.7と5.8を繰り返します。 6。ペプチドの定量トリプトファン残基は溶媒に十分にアクセス可能であるため、タンパク質消化物中のペプチド含量の測定は、希釈緩衝液中で行うことができる。 石英キュベットにABBの0.2ミリリットルをピペット「ブランク」のための発光スペクトルを記録します。 ABBとキュベットと穏やかなミックスに、TSSの1μlをを追加することにより、0.1μgのステップを使用して検量線を作成。 キュベットを清掃してください。 サンプルをピペットスペクトル（サンプル）を記録。 タンパク質およびペプチド濃度の計算 0.1μgのトリプトファンは、B得られたタンパク質の混合物中のトリプトファン含有量の平均1.1％を基準にして約9μgタンパク質（に対応するのでヒト細胞を溶解y）の消化物中のペプチド試料またはコンテンツ内のタンパク質含量は等しい。 ここで、F（標準1）は0.1μgのトリプトファン標準の蛍光である。ペプチド含有量は、消化手順の収率の計算を可能にし、ペプチド分画および質量分析を以下に不可欠な情報を提供する。 7。のLys-Cおよびトリプシンペプチドの分画それぞれBRUB pHが11とpHが5の0.2ミリリットルでのLys-Cおよびトリプシンで消化して得られたペプチド溶液を希釈する。 遠心チューブ·アダプターのふたにおけるSAXチップカラムを組み立てる。 BRUB、のLys-C peptiの分離のためのpH 11の0.1ミリリットルを、メタノール0.1ミリリットルで順次、1M NaOHを0.1ミリリットル、3回のSAXチップ·カラムを洗浄し、平衡化DESとBRUB、トリプシンペプチドのためのpHは5で。カラム材料を通る溶液の流れは、4,000×gでの遠心分離によって促進される。 のLysの分離のための4; 'StageTips' -ウォッシュとC 18平衡化-そしてその後で「StageTips '、メタノール0.05ミリリットル、緩衝液Bの0.05ミリリットルとし、緩衝液Aの0.05ミリリットル6〜18を準備したがCペプチドおよびトリプシンペプチドの分離のため2。 「StageTip ' – C 18におけるSAXヒント列を組み立てます。平衡化SAXヒント – 列にサンプル溶液をロードし、3分間5000×gでカラムを遠心する。 それぞれLYC-Cおよびトリプシンのサンプルに、BRUB、pHが11以上のpH 5の0.1ミリリットルで「ピペットチップ」のカラムを平衡化させます。 5000×gで遠心分離することにより流れを促進。 次のC 18にSAXヒント列を転送- 'StageTip」。 LysのCサンプルおよびBRUでBRUB pHが6,4、および2を有するペプチドの溶出を続けるトリプシンペプチドを含むサンプルのためのB型pHは2。 「StageTip ' -各溶出ステップは、別々のC 18を使用してください。 緩衝液Aの0.05ミリリットルと「StageTips ' – C 18を洗う質量分析計を用いて組み立てられたLCシステムへのサンプルの注入のために直接使用バイアルに緩衝液Bを0.05 mlの画分を溶出する。