Protéomique Préparation de l'échantillon de formol et inclus en paraffine fixe tissus

Une. Instrumentation requis Préparation des tranches de tissu pour microdissection et échantillon lyse Thermoblock réglé sur 99 ° C ou un bain d'eau bouillante. Laser exploitation microdissecteur (par exemple PALM, Zeiss, Göttingen, Allemagne). Thermostaté paillasse centrifugeuse, température réglée à 20 ° C. Chambre humide (boîte) avec un support pour les tubes d'évacuation de type Eppendorf. Incubateur réglé à 37 ° C. Spectrofluorometer permettant la mesure de la fluorescence excitée à proximité de la lumière UV avec des cuves en quartz micro-échelle (0,1-0,2 ml). 2. Solutions «Tissue Lysis Buffer» (TLB): 0,1 M de Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M de DTT, 0,5% (p / v) de polyethylene glycol 20 000 et 4% de SDS. Solution UC: 8 M d'urée dans 0,1 M de Tris-HCl pH 8,5. Préparer 1 ml par 1 échantillon. Solutions UC et de l'AAI doivent être fraîchement préparées et utilisées dans une journée. Solution IAA: 0,05 M iodoacetamide en UC. Préparer 0,1 ml par 1 échantillon. Endoprotéinase Lys-C, la solution mère. Trypsine, la solution mère. «Tampon de digestion» (DB): 0,05 M Tris-HCl pH 8,5. Préparer 0,25 ml par 1 échantillon. «Tryptophane Standard Solution ': 0,1 ug tryptophane dans 1 ml d'eau déminéralisée. Assay tampon B '(ABB): 10 mM Tris-HCl, pH 7,6. Solution mère de Britton & Universal Buffer Robinson (brub). Préparer une solution contenant 0,1 M de CH 3 COOH, 0.1 MH 3 PO 4, et 0,1 MH 3 BO 3 et ajuster avec NaOH 1 M à pH requis (2, 4, 5, 6, et 11). Avant utilisation diluer 5 fois avec de l'eau déminéralisée. Tampon A: 1% (v / v) de CH 3 COOH dans de l'eau désionisée. Tampon B: 60% (v / v) de CH 3 CN, 1% (v / v) de CH3COOH dans l'eau désionisée. 3. Pipette Conseil et colonnes "StageTip ' Préparer SAX pointe-colonne par empilement de 6 couches de membrane Empore-anion dans une common 0,2 ml pointe de la pipette. Faites deux colonnes SAX-pointe par exemple. Préparez 'StageTip' en empilant trois couches de Empore-C 18 dans une pipette de 0,2 ml. Faire 6 conseils de Scène pour chaque échantillon. 4. Préparation des tranches de tissu pour microdissection et d'échantillons de lyse Des sections avec un microtome coupé (l'épaisseur des tranches dépend de l'échantillon. Habituellement microdissection fonctionne bien avec des tranches de 7-10 um). Irradier les diapositives de la membrane (MembraneSlide 1.0 PEN) avec la lumière UV pendant 45 min. Montez les sections sur les lames de la membrane irradier et sec à 37 ° C pendant 2 heures. Déparaffiner les sections montées par deux incubations successives dans le xylène pendant 2,5 minutes et 1,5 min. Réhydrater les sections par des incubations successives dans l'éthanol absolu, 70% d'éthanol et de l'eau, chaque pendant 1 min. Colorer les sections avec l'hématoxyline de Mayer pendant 20 secondes, rincer à l'eau pendant 1 min, et sécher à l'air. Recueillir les populati cellulairesd'intérêt en utilisant le système de microdissection par capture laser. Lors de l'utilisation de l'instrument PALM (Zeiss) collecter les échantillons dans les bouchons adhésifs (adhésif PAC 200). Pipeter une aliquote de la TLB sur le matériau microdisséquée dans le capuchon. Fermer le tube et recueillir la suspension par une courte centrifugation. Lyse la microdissection de tissu à 99 ° C dans un bloc chauffant avec agitation (600 rpm) pendant 1 heure. Utilisez 3 pi de tampon pour 10 nl du tissu microdissection. Clarifier l'extrait brut par centrifugation à 16 000 g à 18 ° C pendant 10 min. Le lysat peut être conservé congelé à -20 ° C. 5. Traitement des échantillons Mélangez jusqu'à 50 pi de lysat clarifié avec 200 pi d'UC dans les unités d'ultrafiltration (30k légale) et centrifuger à 14 000 xg jusqu'à moins de 10 pi de la solution resteront dans le filtre. Habituellement, cette étape nécessite 10-15 min centrifugation. Introduire à la pipette 200 ul d'UC à l'unité d'ultrafiltrationet centrifuger comme en 5.1. Vider le tube de collecte. Pipette 50 ul de solution IAA et mélanger à 600 rpm dans un thermo-mélangeur pendant 1 min et centrifuger comme en 5.1. Introduire à la pipette 100 ul d'UC à l'unité d'ultrafiltration et centrifuger comme en 5.1. Répétez cette étape deux fois Ajouter 100 pi de la DB à l'unité d'ultrafiltration et centrifuger à 5.1. Répétez cette étape deux fois. Transférer les unités de filtration de nouveaux tubes de prélèvement. Introduire à la pipette 40 ul de DB avec l'endoprotéinase Lys-C (protéinase par rapport au total de protéine de 1:100) et mélanger à 600 tpm dans thermo-malaxeur pendant 1 min. Incuber les unités dans une chambre humide à 37 ° C pendant 18 heures. Centrifuger les unités de filtration à 14 000 x g comme dans 5.1. Introduire à la pipette 160 ul d'eau désionisée et on centrifuge les unités de filtre comme dans 5.1. Le flux continu commun (5.7 et 5.8 étapes) contient les peptides libérés par endoprotéinase Lys C. Transférer l'unité d'ultrafiltration à un nouveau tube de collecte. Ajouter 40 ulDB avec de la trypsine (rapport enzyme à protéine 1:100) et mélanger à 600 tpm dans thermo-malaxeur pendant 1 min. Incuber les unités dans une chambre humide à 37 ° C pendant 4 heures. Répétez les étapes 5.7 et 5.8 pour recueillir les peptides tryptiques. 6. La quantification des peptides La mesure de la teneur en peptides dans les produits de digestion de protéines peut être réalisée dans un tampon dilué, parce que les résidus tryptophane sont bien accessibles au solvant. Introduire à la pipette 0,2 ml d'ABB dans la cuvette de quartz et d'enregistrer le spectre d'émission de «blanc». Préparer la courbe d'étalonnage en utilisant 0,1 ug étapes en ajoutant 1 ul aliquotes de TSS à la cuvette et doux mélange avec l'ABB. Nettoyer la cuvette. Pipeter l'échantillon et enregistrer le spectre (échantillon). Calcul de la concentration de protéine et de peptide Etant donné que 0,1 ug tryptophane correspond à environ 9 pg de protéine (sur la base de la moyenne de 1,1% de la teneur en tryptophane dans des mélanges protéiques obtenus by lyser les cellules humaines) la teneur en protéines de l'échantillon ou dans le peptide contenu dans le produit de digestion est égale à: où F (Standard1) est la fluorescence de 0,1 ug norme tryptophane. La teneur en peptide permet de calculer le rendement de la procédure de digestion et fournit des informations essentielles pour le peptide suivant le fractionnement et l'analyse par spectrométrie de masse. 7. Fractionnement des Lys-C et tryptiques peptides Diluer les solutions de peptides obtenus par digestion avec Lys-C et de la trypsine avec 0,2 ml de brub pH 11 et pH 5, respectivement. Monter la pointe SAX-colonne dans la centrifuge couvercle de l'adaptateur de tube. Laver et équilibrer la colonne de bout-SAX successivement avec 0,1 ml de methanol, 0,1 ml de NaOH 1 M, et trois fois avec 0,1 ml de brub, pH 11 pour la séparation de Lys-C Peptides et brub, pH 5 pour les peptides tryptiques. L'écoulement des solutions à travers la matière de la colonne est facilitée par centrifugation à 4000 x g. Laver et équilibrer les C 18 – 'StageTips' ensuite, avec 0,05 ml de methanol, puis avec 0,05 ml de tampon B et avec 0,05 ml de tampon A. Préparer six C 18 – 'StageTips', 4 pour la séparation de la Lys- C peptides et deux pour la séparation des peptides trypsiques. Assemblez le Tip-colonne SAX dans le C 18 – 'StageTip. Chargez les solutions d'échantillon dans les SAX Tip-colonnes équilibrées et centrifuger les colonnes à 5000 g pendant 3 min. Equilibrer les colonnes «pipette à pointe» avec 0,1 ml de la brub, pH 11 ou pH 5, respectivement à la Lyc-C et des échantillons tryptiques. Faciliter la circulation par centrifugation à 5000 x g. Transférer le Tip-colonne SAX pour le prochain C 18 – 'StageTip. Continuer l'élution des peptides avec brub pH 6, 4 et 2 pour l'échantillon C et avec Lys BRUB pH 2 pour l'échantillon avec des peptides tryptiques. Pour chaque étape d'élution utiliser un C séparé 18 – 'StageTip. Laver les C 18 – «StageTips» avec 0,05 ml de tampon A. Éluer des fractions de 0,05 ml de tampon B dans des flacons utilisés directement pour l'injection des échantillons dans le système de LC assemblés avec un spectromètre de masse.