Preparazione del campione proteomica dalla fissati in formalina e incluso in paraffina Tissue

1. Strumentazione necessaria Preparazione di fette di tessuto per microdissezione e il campione lisi Thermoblock impostato a 99 ° C o di una vasca da bagno con acqua bollente. Laser microdissector operativo (ad esempio PALM, Zeiss, Göttingen, Germania). Termostatato da banco centrifuga, la temperatura impostata a 20 ° C. Camera umida (box) con un rack per tubi di smaltimento Eppendorf tipo. Incubatore a 37 ° C. Spettrofluorimetro consentendo di misurazione della fluorescenza eccitata vicino a luce UV con cuvette di quarzo micro-scala (0,1-0,2 ml). 2. Soluzioni 'Tissue Lysis Buffer' (TLB): 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 M DTT, 0.5% (w / v) di polietilenglicole 20.000 e 4% SDS. Soluzione UA: 8 M urea in 0,1 M Tris-HCl pH 8.5. Preparare 1 ml per 1 campione. Le soluzioni UA e IAA devono essere preparate al momento e utilizzati entro un giorno. Soluzione IAA: 0,05 M iodoacetamide in UA. Preparare 0.1 ml per 1 campione. Endoproteinase Lys-C, soluzione stock. Tripsina, soluzione stock. 'Digestione del buffer' (DB): 0,05 M Tris-HCl pH 8.5. Preparare 0,25 ml per 1 campione. 'Triptofano Soluzione Standard': 0,1 mg di triptofano in 1 ml di acqua deionizzata. 'Assay buffer di B' (ABB): 10 mM Tris-HCl, pH 7,6. Soluzione madre di Britton & Robinson Tampone universale (BRUB). Preparare una soluzione contenente 0,1 M CH 3 COOH, 0,1 MH 3 PO 4, e 0,1 MH 3 BO 3 e regolare con 1 M NaOH al pH desiderato (2, 4, 5, 6, e 11). Prima dell'uso diluire 5 volte con acqua deionizzata. Tampone A: 1% (v / v) CH 3 COOH in acqua deionizzata. Tampone B: 60% (v / v) CH 3 CN, 1% (v / v) CH3COOH in acqua deionizzata. 3. Pipetta Tip e colonne "StageTip ' Preparare SAX tip-colonna impilando 6 strati di membrana Empore-anioni in un common 0,2 ml punta della pipetta. Fare due colonne SAX-tip per campione. Preparare 'StageTip' impilando 3 strati di Empore-C 18 in un puntale di 0,2 ml. Effettuare 6 punte palco per ogni campione. 4. Preparazione di fette di tessuto per Microdissection e dei Campioni Lysis Tagliare sezioni con un microtomo (lo spessore delle fette dipende dal campione. Solitamente microdissezione funziona bene con le fette di 7-10 micron). Irradiare diapositive membrana (MembraneSlide 1.0 PEN) con raggi UV per 45 min. Montare le sezioni sui vetrini di membrana irradiare e asciutto, a 37 ° C per 2 ore. Sparaffinare e portare le sezioni montati da due incubazioni successive in xilene per 2,5 minuti e 1,5 min. Reidratare le sezioni da incubazioni consecutivi in ​​etanolo assoluto, etanolo al 70% e acqua, ciascuno per 1 min. Macchiare le sezioni con ematossilina di Mayer per 20 secondi, sciacquare con acqua per 1 minuto, e aria secca. Raccogliere le populati cellularisu interessi utilizzando il sistema di microdissezione laser capture. Quando si utilizza lo strumento PALM (Zeiss) raccogliere i campioni nei tappi adesivi (adesivi PAC 200). Pipettare un'aliquota del TLB sul materiale microdissezione nel tappo. Chiudere la provetta e raccogliere la sospensione con un breve centrifugazione. Lyse tessuto microdissezione a 99 ° C su una piastra riscaldante con agitazione (600 rpm) per 1 ora. Utilizzare 3 ml di tampone per 10 nl del tessuto microdissezione. Chiarire l'estratto grezzo mediante centrifugazione a 16.000 xg a 18 ° C per 10 min. Il lisato può essere conservati congelati a -20 ° C. 5. Elaborazione del campione Mescolare fino a 50 ml di lisato chiarificato con 200 ml di UA nelle unità di ultrafiltrazione (30k forense) e centrifugare a 14000 g fino a meno di 10 microlitri della soluzione rimarranno nel filtro. Di solito questo passo richiede 10-15 minuti centrifugazione. Pipettare 200 ml di UA all'unità di ultrafiltrazionee centrifugare come in 5.1. Svuotare il tubo di raccolta. Pipettare 50 ml di soluzione di IAA e miscelare a 600 rpm in una termo-mixer per 1 min e centrifugare come in 5.1. Aggiungere 100 ml di UA all'unità di ultrafiltrazione e centrifugare come in 5.1. Ripetere questa operazione due volte Dispensare 100 ml di DB all'unità di ultrafiltrazione e centrifugare a 5.1. Ripetere questa operazione due volte. Trasferire le unità di filtrazione a nuovi tubi di raccolta. Pipettare 40 microlitri DB con endoproteinase Lys-C (proteinasi rapporto proteine ​​totali di 1:100) e miscelare a 600 rpm in termo-mixer per 1 min. Incubare le unità in una camera umida a 37 ° C per 18 ore. Centrifugare le unità filtranti a 14000 g come in 5.1. Pipettare 160 ml di acqua deionizzata e centrifugare le unità filtranti come in 5.1. La flow-through pool (5.7 e 5.8 punti) contiene i peptidi rilasciati da endoproteinase Lys C. Trasferire unità di ultrafiltrazione a un nuovo tubo di raccolta. Aggiungere 40 microlitriDB con tripsina (enzima proteina rapporto 1:100) e miscelare a 600 rpm in termo-mixer per 1 min. Incubare le unità in una camera umida a 37 ° C per 4 ore. Ripetere i punti 5.7 e 5.8 per raccogliere i peptidi triptici. 6. La quantificazione dei peptidi La misurazione del contenuto di peptide in digest proteina può essere eseguita in tampone diluito perché i residui di triptofano sono ben accessibile al solvente. Pipettare 0,2 ml di ABB in cuvetta di quarzo e registrare lo spettro di emissione di 'vuoto'. Preparare curva di calibrazione utilizzando 0,1 mg passi con l'aggiunta di 1 ml aliquote TSS alla cuvetta e delicato mix con la ABB. Pulire la cuvetta. Pipettare il campione e registrare lo spettro (campione). Calcolo della concentrazione di proteine ​​e peptidi Da 0.1 mg triptofano corrisponde a circa 9 mg proteina (basata sulla media 1.1% del contenuto di triptofano in miscele proteiche ottenute by lisi cellule umane), il contenuto proteico della a contenuto campione o peptide nel digest è pari a: dove F (Standard1) è la fluorescenza di 0.1 mg standard di triptofano. Il contenuto peptide permette di calcolare la resa del procedimento digestione e fornisce informazioni essenziali per seguenti peptide frazionamento e spettrometria di massa. 7. Il frazionamento delle Lys-C e trittico peptidi Diluire le soluzioni di peptidi ottenuti dalla digestione con Lys-C e tripsina con 0,2 ml di BRUB pH 11 e pH 5, rispettivamente. Montare la punta della colonna SAX nella centrifuga coperchio dell'adattatore tubo. Lavare ed equilibrare la punta-colonna SAX successivamente con 0,1 ml di metanolo, 0,1 ml di 1 M NaOH, e 3 volte con 0,1 ml di BRUB, pH 11 per la separazione di Lys-C Peptides e con BRUB, pH 5 per i peptidi triptici. Il flusso delle soluzioni mediante il materiale della colonna è facilitato mediante centrifugazione a 4000 x g. Lavare ed equilibrare le C 18 – 'StageTips' successivamente, con 0,05 ml di metanolo, poi con 0,05 ml di tampone B e con 0,05 ml di tampone A. Preparare sei C 18 – 'StageTips; 4 per la separazione del Lys- peptidi C e due per la separazione dei peptidi triptici. Montare il SAX Tip-colonna della C 18 – 'StageTip'. Caricare le soluzioni campione nelle SAX Tip colonne equilibrate e centrifugare le colonne a 5.000 xg per 3 min. Equilibrare le colonne "pipetta a punta" con 0,1 ml di BRUB, pH 11 o pH 5, rispettivamente al Lyc-C e campioni triptici. Facilitare il flusso mediante centrifugazione a 5.000 x g. Trasferire la Tip-colonna SAX alla prossima C 18 – 'StageTip'. Continua eluizione dei peptidi con BRUB pH 6, 4 e 2 per il campione Lys C e con BRUB pH 2 per il campione con peptidi triptici. Per ogni fase di eluizione usare un C separato 18 – 'StageTip'. Lavare le C 18 – 'StageTips' con 0,05 ml di tampone A. Eluire frazioni con 0,05 ml di tampone B in fiale utilizzate direttamente per l'iniezione dei campioni nel sistema LC assemblati con uno spettrometro di massa.