التوليف، تسليم الخلوية و<em> في الجسم الحي</em> تطبيق مجسات درجة الحموضة مقرها Dendrimer-
Summary
أجهزة الاستشعار مضان هي أدوات قوية في علوم الحياة. نحن هنا وصف منهجية لتجميع واستخدام أجهزة الاستشعار الفلورسنت القائم لقياس درجة الحموضة dendrimer في الخلايا الحية والحية. السقالة شجيري يعزز خصائص الأصباغ الفلورية مترافق مما يؤدي إلى تحسين خصائص الاستشعار عن بعد.
Abstract
وضع مؤشرات الفلورسنت يمثل ثورة لعلوم الحياة. المرمزة وراثيا وfluorophores الاصطناعية مع قدرات الاستشعار يسمح التصور من الأنواع ذات الصلة من الناحية البيولوجية مع القرار المكانية والزمانية عالية. الأصباغ الاصطناعية هي من سيما بفضل اهتمام tunability عالية ومجموعة واسعة من analytes قابلة للقياس. ومع ذلك، هذه الجزيئات تعاني العديد من القيود المتعلقة السلوك جزيء صغير (الفقراء الذوبان، صعوبات في الاستهداف، في كثير من الأحيان لا يسمح التصوير ratiometric). في هذا العمل ونحن نقدم تطوير أجهزة الاستشعار القائم على dendrimer وتقديم إجراء لقياس درجة الحموضة في المختبر، في الخلايا الحية والحية. نختار dendrimers كمنصة مثالية لأجهزة الاستشعار لدينا لخصائصها العديد من المرغوب فيه (monodispersity، خصائص الانضباطي، multivalency) التي جعلتهم سقالة تستخدم على نطاق واسع لعدة أجهزة الطبية الحيوية. والاقتران من درجة الحموضة الفلورسنتقاد مؤشرات لالسقالة dendrimer إلى تعزيز أداء الاستشعار الخاصة بهم. على وجه الخصوص dendrimers المعرض تقليل تسرب الخلايا، وتحسين استهداف الخلايا وتسمح قياسات ratiometric. تم توظيف هذه المجسات رواية بنجاح لقياس درجة الحموضة في الخلايا الحية في الجسم الحي وهيلا في مخ الفأر.
Introduction
استخدام جزيئات الفلورسنت لتسمية جزيئات محددة بيولوجيا ذات الصلة قد تغير تماما طريقة ندرس النظم البيولوجية. Widefield ومتحد البؤر المجهري يسمح لفي الوقت الحقيقي عالية الدقة التصور من العمليات البيولوجية وهذه الأيام هي من بين التقنيات الأكثر شعبية لدراسة الأحداث البيولوجية في المختبر، في الخلايا في الجسم الحي و. ومثلت 1 تحسن ذات الصلة من خلال تطوير مؤشرات مضان ، أي الأصباغ التي مضان يعتمد على تركيز كيان الجزيئي محددة. وكان الرقم الهيدروجيني المؤشرات والكالسيوم على وجه الخصوص لها تأثير كبير على دراسة علم وظائف الأعضاء الخلية نظرا لأهمية هائلة من H + وأيونات الكالسيوم 2 + في علم الأحياء. 2،3
ومع ذلك، فإن معظم الأصباغ الاستشعار الحالية العديد من القيود الجوهرية المتعلقة سلوكهم صغيرة جزيء مثل: ط) صعوبات في targeti التحت خلويةنانوغرام؛ ب) القابلية للذوبان الفقراء في مجال المياه وبالتالي سوء توافق مع الحياة؛ والثالث) تسرب الخلايا وبالتالي عدم وجود طويل الوقت الفاصل بين قدرة التصوير 4 وعلاوة على ذلك، في إشارة للعديد من تحقيقات لا يمكن تصحيحها عن الاعتماد على تركيز صبغة (غير التصوير ratiometric)، وبالتالي، على قياس المطلق في الخلايا في الجسم الحي أو غير ممكن.
وصفنا مؤخرا منهجية بسيطة وفعالة للتغلب على هذه القيود، على أساس اقتران من الأصباغ الاستشعار على السقالة dendrimer. 5 Dendrimers والبوليمرات hyperbranched monodisperse مع خصائص جذابة جدا للتطبيقات البيولوجية. 6 على وجه الخصوص وقد وضعت عدة أبنية شجيري واستخدامها لمكافحة المخدرات و7 وتوصيل الجينات. 8 فقط بدأت العديد من المجموعات قريب جدا لاستكشاف إمكانات هذه الجزيئات كما سقالة لأجهزة الاستشعار عن بعد. 9،10،11
نحن سابقاوصف طريقا سهلا نحو الاصطناعية functionalization من polyamidoamine مختلفة (PAMAM) السقالات على أساس استرات NHS تفعيلها. يمكن الحصول على 12 يصرف في خطوة واحدة عن طريق غسيل الكلى كما تنقية فقط. ومن المثير للاهتمام هذا النهج يمكن بسهولة أن تطبق على مجموعة متنوعة من السقالات شجيري أو البوليمر. 13،14
لتحقيق dendrimers التصوير ratiometric كانت المزدوج المسمى مع مجموعتين من الأصباغ: ط) مؤشر الرقم الهيدروجيني (أي فلوريسئين) والثاني) شاردة الفلورسنت درجة الحموضة مستقلة (أي رودامين). يسمح هذا لنا لأداء دقيقة التصوير ودرجة الحموضة والنسبة بين فلوريسئين ورودامين يعتمد فقط على درجة الحموضة وليس أكثر على تركيز التحقيق. ويمثل نهج أخرى مثيرة للاهتمام لهذه المشكلة عن طريق استخدام المجسات القائمة على عمر 15. وعمر لا يعتمد على تركيز التحقيق هذه القياسات لا تحتاج إلى تصحيح ratiometric. ومع ذلك، ليفقياسات etime تتطلب الإعداد فعال أكثر تعقيدا وحلها الزمني هو دون المستوى الأمثل للعمليات الفسيولوجية السريعة، مما يحد من تطبيقاتها المحتملة.
من أجل أداء التصوير داخل الخلايا، يحتاج التحقيق ليتم تسليمها عبر غشاء البلازما في العصارة الخلوية. كما dendrimers لا نفاذية غشاء نظرا لحجمها وhydrophilicity، يمكن أن يتحقق من خلال التسليم داخل الخلايا التثقيب الكهربائي. عن طريق هذا الأسلوب، وتستخدم على نطاق واسع في علم الأحياء لترنسفكأيشن، وصفت الجزيئات يمكن تسليمها على نحو فعال في الخلايا لأداء التصوير عالية الجودة. علاوة على ذلك، مع التثقيب الكهربائي المضاعفات المتصلة dendrimer الإلتقام يمكن تجنبها كما يتم تسليم الجزيئات مباشرة إلى السيتوبلازم. ومن المثير للاهتمام بعد التثقيب الكهربائي dendrimers مختلفة يبين تعريب متميزة داخل الخلايا حتى في غياب أي تسلسل استهداف محددة. 5 هذا passivه الاستهداف، فقط بسبب الخصائص الفيزيائية والكيميائية للdendrimer، يمكن استغلالها لتحقيق عضية محددة التصوير الحموضة.
التصوير Ratiometric يمكن تنفيذها باستخدام متحد البؤر المجهري. فلوريسئين ورودامين، مترافق تساهميا إلى السقالة شجيري، تم تصويرها بشكل منفصل وأنشئت بكسل حسب بكسل نسبة الخريطة. تم الإبلاغ عن عدة إجراءات للسيطرة على الخلايا ودرجة الحموضة في الخلايا الحية عن طريق ionophores. Ionophores هي عبارة عن جزيئات صغيرة مسعور قادرة على نقل أيونات عبر غشاء البلازما؛ ionophores لH + أيون، مثل nigericin، تتوفر، ويمكن استخدامها لمعايرة أجهزة الاستشعار القائم على dendrimer كشفت هذه القياسات 16 استجابة خطية لدرجة الحموضة على غرار ما لوحظ. في المختبر. على أساس درجة الحموضة المعايرة داخل الخلايا يمكن قياسها بدقة. أظهرت هذه القياسات أن أجهزة الاستشعار القائم على dendrimer يمكن أن يكون أداة قيمة في دراسة H + homeostأسيس في الخلايا الحية والعمليات المرضية التي تنطوي على درجة الحموضة الأعطال التنظيم.
أثبتنا مؤخرا أن أجهزة الاستشعار درجة الحموضة القائم على dendrimer يمكن أن تطبق أيضا في الجسم الحي، وأداء التصوير الحموضة في دماغ الفئران تخدير 17 نظرا لبيئة معقدة من الأنسجة الحية ذات جودة عالية في الجسم الحي الاستشعار يمثل تحديا تقنيا. نحن هنا تظهر وصف مفصل للإجراءات التجريبية لدرجة الحموضة في الجسم الحي التصوير مع التركيز في القضايا المصيرية التي ينبغي معالجتها لإجراء التصوير الحموضة دقيقة في الدماغ. واستخدمت اثنين من الفوتون المجهري لسببين رئيسيين: ط) استخدام ضوء الأشعة تحت الحمراء يسمح للتغلب على النقص في اختراق الأنسجة من معيار متحد البؤر المجهري؛ ب) على نطاق واسع امتصاص اثنين من الفوتون من فلوريسئين ورودامين تسمح الإثارة في نفس الوقت تجنب المضاعفات المتصلة باستخدام اثنين من موجات الإثارة ل. كانت قياسات درجة الحموضة في مخ الفأرنفذت بنجاح؛ أجهزة الاستشعار تستجيب بسهولة لنقص الأكسجة لحث على تغيير درجة الحموضة في الفضاء خارج الخلية في الدماغ. تثبت هذه القياسات أن المؤشرات القائمة على dendrimer يمكن استخدامها بنجاح لتسليط الضوء على التغيير الفسيولوجية والمرضية من درجة الحموضة في الجسم الحي في نموذج حيواني.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الحاسمة لنجاح التصوير الحموضة مع أجهزة الاستشعار القائم على dendrimer هي: ط) اختيار السقالة شجيري الصحيح وعدد من المؤشرات مترافق إليها وب) الاستفادة المثلى من بروتوكول تسليم الاستشعار في الخلايا أو في الجسم الحي.
الإجرا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
واعترف مناقشات مفيدة مع Isja دي Feijter ومات بيكر بامتنان.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| PAMAM G4 | Sigma-Aldrich | 412449 | |
| Carboxyfluorescein NHS ester | Life technologies | C-1311 | |
| TMR NHS ester | Life technologies | C-1171 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Dyalsis bags | Spectrum Labs | 132117 | |
| WillCo Dishes | WillCo Wells | GWSt-3512 | |
| Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 |
References
- Giepmans, B. N. G., Adams, S. R., Ellisman, M. H., Tsien, R. Y. The Fluorescent Toolbox for Assessing Protein Location and Function. Science. 312 (5771), 217-224 (2006).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. The Journal of biological chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chemical reviews. 110 (5), 2709-2728 (2010).
- Silver, R. A., Whitaker, M., Bolsover, S. R. Intracellular ion imaging using fluorescent dyes: artefacts and limits to resolution. Pflügers Archiv: European journal of physiology. 420 (5-6), 595-602 (1992).
- Albertazzi, L., Storti, B., Marchetti, L., Beltram, F. Delivery and Subcellular Targeting of Dendrimer-Based Fluorescent pH Sensors in Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18158-18167 (2010).
- Lee, C. C., MacKay, J. A., Fréchet, J. M. J., Szoka, F. C. Designing dendrimers for biological applications. Nature Biotechnology. 23 (12), 1517-1526 (2005).
- Lee, C. C., Gillies, E. R., et al. A single dose of doxorubicin-functionalized bow-tie dendrimer cures mice bearing C-26 colon carcinomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16649-16654 (2006).
- Caminade, A. -. M., Turrin, C. -. O., Majoral, J. -. P. Dendrimers and DNA: combinations of two special topologies for nanomaterials and biology. Chemistry (Weinheim an der Bergstrasse, Germany). 14 (25), 7422-7432 (2008).
- Rakow, N. A., Suslick, K. S. A colorimetric sensor array for odour visualization. Nature. 406 (6797), 710-713 (2000).
- Armada, M. P. G., Losada, J., Zamora, M., Alonso, B., Cuadrado, I., Casado, C. M. Electrocatalytical properties of polymethylferrocenyl dendrimers and their applications in biosensing. Bioelectrochemistry (Amsterdam, Netherlands). 69 (1), 65-73 (2006).
- Finikova, O., Galkin, A., Rozhkov, V., Cordero, M., Hägerhäll, C., Vinogradov, S. Porphyrin and tetrabenzoporphyrin dendrimers: tunable membrane-impermeable fluorescent pH nanosensors. Journal of the American Chemical Society. 125 (16), 4882-4893 (2003).
- Albertazzi, L., Serresi, M., Albanese, A., Beltram, F. Dendrimer internalization and intracellular trafficking in living cells. Molecular pharmaceutics. 7 (3), 680-688 (2010).
- Albertazzi, L., Mickler, F. M., et al. Enhanced bioactivity of internally functionalized cationic dendrimers with PEG cores. Biomacromolecules. , (2012).
- Albertazzi, L., Fernandez-Villamarin, M., Riguera, R., Fernandez-Megia, E. Peripheral Functionalization of Dendrimers Regulates Internalization and Intracellular Trafficking in Living Cells. Bioconjugate chemistry. , (2012).
- Sakadzić, S., Roussakis, E., et al. Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue. Nature. 7 (9), 755-759 (2010).
- Bizzarri, R., Arcangeli, C., et al. Development of a novel GFP-based ratiometric excitation and emission pH indicator for intracellular studies. Biophysical journal. 90 (9), 3300-3314 (2006).
- Albertazzi, L., Brondi, M., et al. Dendrimer-based fluorescent indicators: in vitro and in vivo applications. PloS one. 6 (12), e28450 (2011).
- Amir, R. J., Albertazzi, L., Willis, J., Khan, A., Kang, T., Hawker, C. J. Multifunctional Trackable Dendritic Scaffolds and Delivery Agents. Angewandte Chemie International Edition. 50 (15), 3425-3429 (2011).
- Arosio, D., Ricci, F., Marchetti, L., Gualdani, R., Albertazzi, L., Beltram, F. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nature methods. 7 (7), 516-518 (2010).
- Brondi, M., Sato, S. S., Rossi, L. F., Ferrara, S., Ratto, G. M. Finding a Needle in a Haystack: Identification of EGFP Tagged Neurons during Calcium Imaging by Means of Two-Photon Spectral Separation. Frontiers in molecular neuroscience. 5, 96 (2012).
- Ziemann, A. E., Schnizler, M. K., et al. Seizure termination by acidosis depends on ASIC1a. Nature neuroscience. 11 (7), 816-822 (2008).
- . . Molecular Probes Handbook, A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , (2010).
