Синтез, Сотовый Доставка и<em> В естественных условиях</em> Применение датчиков рН Дендримеров основе

Использование флуоресцентных молекул маркировать определенные биологически-соответствующие молекулы полностью изменил способ, которым мы учиться биологических систем. Широкоугольный и конфокальной микроскопии позволило в режиме реального времени с высоким разрешением визуализации биологических процессов и в настоящее время являются одними из самых популярных методов для изучения биологических событий в пробирке, в клетках и в естественных условиях. ¹ Соответствующий улучшение представляли разработки показателей флуоресценции , т.е. красителей, флуоресценция зависит от концентрации специфического молекулярного лица. рН и кальция показатели, в частности, имел огромное влияние на изучении физиологии клетки из-за огромного актуальности ^{2 +} в биологии Н ⁺ и Ca. ^2,3

Тем не менее, большинство из красителей зондирования присутствующих несколько внутренние ограничения, связанные с их небольшой поведения молекул, таких как: I) трудности в субклеточной targetiнг; II) плохой растворимостью в воде и, следовательно, плохой биосовместимостью;. и III) утечка клеток и, следовательно, отсутствие долгого изображений возможностью покадровой ⁴ Кроме того, сигнал из множества зондов не может быть исправлена ​​в зависимости от концентрации красителя (не изображений пропорциональный) и, следовательно, абсолютное измерение в клетках или в естественных условиях невозможно.

Мы недавно описал простой и эффективной методологии преодоления этих ограничений, на основе сопряжения красителей зондирования на дендримеров эшафот. ⁵ Дендримеры Монодисперсные гиперразветвленные полимеры с очень привлекательных свойств для биологических применений. ⁶ В частности несколько дендритные архитектуры были разработаны и используются для приготовления ⁷ и доставки генов. ⁸ Только в самое последнее несколько групп начали исследовать потенциал этих молекул как эшафот для сенсорных устройств. ^9,10,11

Мы ранееописан простой путь синтеза по отношению к функционализации другой полиамидоамина (РАМАМ) строительные леса, основанный на NHS-активированных сложных эфиров. ¹² Конъюгаты могут быть получены в одну стадию путем диализа, как только очистки. Интересно этот подход может быть легко применена к различным дендритных или полимерных каркасов. ^13,14

Для достижения логометрических дендримеров изображений были дважды меченных с двумя наборами красителей: I) индикаторных рН (т.е. флуоресцеин) и б) рН-независимый флуоресцентный фрагмент (т.е. родамин). Это позволило выполнить точный изображений рН как отношение между флуоресцеин и родамин только зависит от рН и не более от концентрации зонда. Другой интересный подход к этому вопросу представлена ​​использования в течение жизни на основе зондов. ¹⁵ Как время жизни не зависит от концентрации зонда эти измерения не нужен логометрические коррекции. Тем не менее, LIFИзмерения Etime требуют более сложный инструментальную установки и их временное разрешение является оптимальным для быстрых физиологических процессов, тем самым ограничивая их возможности применения.

Для того чтобы выполнить внутриклеточного изображений, зонд должен быть доставлен через плазматическую мембрану в цитозоль. Поскольку дендримеры не проницаемой мембраны из-за их размера и гидрофильности, внутриклеточной доставки может быть достигнуто путем электропорации. С помощью этой методики, широко используемые в биологии для трансфекции, меченные макромолекулы могут быть эффективно доставлены в клетки, чтобы выполнить высокое качество изображения. Кроме того, при электропорации осложнений, связанных с дендримера эндоцитоза можно избежать как макромолекулы доставляется в цитоплазме. Интересно после электропорации различных дендримеров показывает различные локализации внутри клеток, даже в отсутствии каких-либо конкретных таргетирования последовательности. ⁵ этого Passivэ ориентации, только за счет физико-химических свойств дендримере, могут быть использованы для достижения органеллоспецифичными изображений рН.

Логометрический изображений можно выполнить с помощью конфокальной микроскопии. Флуоресцеин и родамин, ковалентно конъюгирован с дендритной строительных лесов, были отображены отдельно и пиксель-на-пиксель соотношение карта была создана. Несколько процедур по контролю внутриклеточного рН в живых клетках с помощью ионофоров не поступало. Ионофоры небольшие гидрофобные молекулы, способные транспортировать ионы через плазматическую мембрану; ионофоры для Н ⁺ ионов, таких как нигерицина, доступны и могут быть использованы для калибровки датчиков на основе дендримеров ¹⁶ Эти измерения показали линейную реакцию на рН аналогично тому, что наблюдалось. в пробирке. На основе калибровочной внутриклеточного рН может быть точно измерена. Эти измерения показали, что дендример основе датчика может быть ценным инструментом в исследовании Н ⁺ homeostASIS в живых клетках и патологических процессов, которые связаны сбои регулирования рН.

Недавно мы показали, что дендример основе датчики рН также может быть применен в естественных условиях, выполняя изображений рН в головном мозге анестезированных мышах. ¹⁷ Из-за сложной среде живых тканей высокого качества в естественных зондирования является технически сложной задачей. Здесь мы показываем, подробное описание экспериментальной процедуры в естественных условиях рН изображений с акцентом из важнейших вопросов, которые будут рассматриваться для выполнения точной визуализации рН в мозге. Двухфотонное микроскопии был принят на работу по двум основным причинам: я) использование инфракрасного света позволяет преодолеть отсутствие проникновения в ткани стандартного конфокальной микроскопии; II) широкий двухфотонного поглощения флуоресцеина и родамина позволит избежать их одновременное возбуждение осложнения, связанные с использованием двух длин волн возбуждения. измерения рН в мозге мыши былиуспешно проведены; датчики легко реагировать на гипоксию вызывают изменение рН в мозге внеклеточного пространства. Эти измерения показывают, что дендримеров на основе показателей может быть успешно использован для выделения физиологических и патологических изменение рН в естественных условиях в животной модели.