Synthèse, Livraison cellulaire et<em> In vivo</em> Utilisation de capteurs de pH à base de dendrimères

L'utilisation de molécules fluorescentes pour marquer des molécules biologiquement pertinentes spécifiques a complètement changé la façon dont nous étudions les systèmes biologiques. Widefield et la microscopie confocale a permis un temps réel à haute résolution de visualisation de processus biologiques et sont aujourd'hui parmi les techniques les plus populaires pour étudier les événements biologiques in vitro, dans des cellules et in vivo. ¹ Une amélioration pertinente a été représentée par l'élaboration d'indicateurs de fluorescence , c'est à dire des colorants dont la fluorescence dépend de la concentration d'une entité moléculaire spécifique. pH et de calcium indicateurs en particulier ont eu un impact dramatique sur l'étude de la physiologie de la cellule en raison de l'énorme importance de H ⁺ et Ca ^{2 +} dans la biologie. ^2,3

Cependant, la plupart des colorants de détection présentent plusieurs limites intrinsèques liés à leur petite molécule comportements tels que: i) des difficultés à targeti subcellulaireng, ii) une faible solubilité dans l'eau et par conséquent une mauvaise biocompatibilité,., et iii) des fuites de cellules et donc un manque de capacité à long imagerie time-lapse ⁴ En outre, le signal de plusieurs sondes ne peut pas être corrigée en fonction de la dépendance de la concentration de colorant (non Imagerie ratiométrique) et, par conséquent, une mesure absolue dans des cellules ou in vivo n'est pas possible.

Nous avons récemment décrit une méthode simple et efficace pour surmonter ces limitations, en fonction de la conjugaison de colorants de détection sur un échafaudage de dendrimère. ⁵ Les dendrimères sont des polymères hyper-ramifiés monodispersés avec des propriétés très attrayantes pour des applications biologiques. ⁶ en particulier plusieurs architectures dendritiques ont été mis au point et utilisé pour le médicament ⁷ et la livraison de gènes. ⁸ n'est que très récemment plusieurs groupes ont commencé à explorer le potentiel de ces molécules comme échafaudage pour dispositifs de détection. ^9,10,11

Nous avons déjàdécrit une voie de synthèse facile vers la fonctionnalisation différente de polyamidoamine (PAMAM) des échafaudages à base d'esters de NHS-activées. conjugués peuvent ¹² être obtenus en une seule étape au moyen d'une dialyse en tant que purification. Fait intéressant, cette approche peut facilement être appliquée à une variété d'échafaudages dendritiques ou polymères. ^13,14

Pour atteindre les dendrimères d'imagerie ratiométrique étaient doublement marquée avec deux ensembles de colorants: i) un indicateur de pH (par exemple la fluorescéine) et ii) un fragment fluorescent indépendante du pH (par exemple la rhodamine). Cela nous a permis d'effectuer une imagerie précise du pH comme le rapport entre la fluorescéine et la rhodamine est seulement dépendante du pH et de pas plus de la concentration de la sonde. Une autre approche intéressante à ce sujet est représenté par l'utilisation de sondes à base de vie. ¹⁵ Comme la durée de vie ne dépend pas de la concentration de la sonde ces mesures n'ont pas besoin d'une correction de quotient. Cependant, lifmesures de etime nécessitent une configuration instrumentale plus complexe et leur résolution temporelle est sous-optimale pour les processus physiologiques rapides, limitant ainsi leurs applications potentielles.

Dans le but d'effectuer une imagerie intracellulaire, la sonde doit être délivré à travers la membrane plasmique dans le cytosol. Comme les dendrimères sont pas perméable en raison de leur taille et leur caractère hydrophile, la délivrance intracellulaire pourrait être réalisé par électroporation. Au moyen de cette technique, largement utilisé en biologie pour la transfection, les macromolécules marquées peuvent être exécutés de manière efficace dans des cellules d'effectuer une imagerie de haute qualité. En outre, l'électroporation avec les complications liées à dendrimère endocytose peuvent être évités en tant que les macromolécules sont directement remis au cytoplasme. Intéressant après électroporation différents dendrimères montre localisations distinctes à l'intérieur des cellules, même en l'absence de toute séquence de ciblage spécifique. ⁵ Ce passife ciblage, seulement en raison des propriétés physico-chimiques du dendrimère, pourrait être exploitée pour obtenir un pH d'imagerie spécifiques à des organites.

Imagerie ratiométrique peut être effectuée en utilisant la microscopie confocale. La fluorescéine et la rhodamine, conjugué de manière covalente à l'échafaud dendritique, ont été séparément imagées et un rapport carte pixel par pixel a été créé. Plusieurs procédures de contrôle le pH intracellulaire dans les cellules vivantes au moyen d'ionophores ont été signalés. Ionophores sont de petites molécules hydrophobes capables de transporter des ions à travers la membrane plasmique; ionophores pour ion H ^+, comme nigéricine, sont disponibles et peuvent être utilisés pour étalonner les capteurs à base de dendrimères ¹⁶ Ces mesures ont révélé une réponse linéaire de pH similaire à ce qui est observé. in vitro. Sur la base de l'étalonnage du pH intracellulaire peut être mesurée avec précision. Ces mesures ont démontré que le capteur à base de dendrimères peut être un outil précieux dans l'étude H ⁺ homeostasis dans les cellules vivantes et les processus pathologiques qui impliquent pH dysfonctionnements de régulation.

Nous avons récemment démontré que les capteurs de pH à base de dendrimères peuvent également être appliqués in vivo, effectuer une imagerie de pH dans le cerveau de souris anesthésiées. ¹⁷ En raison de l'environnement complexe des tissus vivants de haute qualité dans la détection in vivo est techniquement difficile. Ici, nous montrons une description détaillée de la procédure expérimentale in vivo pour pH imagerie avec un accent des questions cruciales à traiter pour effectuer une imagerie précise du pH dans le cerveau. Microscopie à deux photons a été utilisé pour deux raisons principales: i) l'utilisation de la lumière infrarouge permet de pallier le manque de pénétration tissulaire de la microscopie confocale norme; ii) la large absorption à deux photons de la fluorescéine et de la rhodamine permettre leur excitation simultanée d'éviter la les complications liées à l'utilisation de deux longueurs d'onde pour l'excitation. des mesures de pH dans le cerveau de la souris étaientmenées à bien; capteurs répondent que difficilement à l'hypoxie induire des changements de pH dans l'espace extracellulaire du cerveau. Ces mesures montrent que les indicateurs à base de dendrimères peuvent être utilisés avec succès pour mettre en évidence les changements physiologiques et pathologiques de pH in vivo dans un modèle animal.