Murin Dişeti Hücre İzolasyonu, İşleme ve Analiz
Summary
Bu çalışma, bir tek hücre kültürü üretmek için fare ağız boşluğundan gingival dokular izole etmek ve işlemek için etkili bir yöntem açıklanır. Ortaya çıkan hücreler bir başka akış sitometri analizi ve klinik çalışmalar için kullanılabilir.
Abstract
Biz tam olarak izole ve akım sitometri ve moleküler çalışmalar için fare dişeti doku işlemek için bir teknik geliştirdik. Dişeti bu periodontal hastalıklara neden olabilir sözlü biyofilm karşı konağın immün yanıtı yer olduğu için bağışıklık mekanizmaları incelemek için eşsiz ve önemli bir dokudur. Ayrıca, alveoler kemik dokusu için dişetinin yakın da enflamatuvar durumlarda kemik yeniden eğitim sağlayan. Bizim yöntemi daha önce 1 gösterdiği gibi Langerhans hücreleri ve T düzenleyici hücreleri gibi daha nadir hücre popülasyonlarının analizi sağlayan bağışıklık hücrelerinin büyük miktarda verir. Periodontal hastalıklar sırasında alveol kemik kaybı dahil yerel immün yanıtları incelemek için istihdam fareler nedeniyle çeşitli immünolojik ve deneysel araçların durumu avantajlıdır. Bununla birlikte, kendi küçük boyutu ve fare dişeti için nispeten uygunsuz erişim nedeniyle, birçok çalışma thi incelenmesi kaçınılmalıdırs kritik doku. Bu çalışmada açıklanan yöntemi umarım periodontal hastalıklar sırasında sözlü bağışıklık sistemi ve rolünü bizim understating artacak dişeti analizi, kolaylaştırabilir.
Introduction
Gingiva diş serviks kısmı çevreleyen yumuşak doku ve alveol (Şekil 1) kapsar. Dişeti daha mukozal epitel ve bağ dokusu (aynı zamanda submukozaya ya da lamina propria olarak da bilinir) ayrılabilir çiğneme mukoza türüdür. Dişeti ve komşu dişlerin anatomik yapısı bakteriler sürekli yerel bağışıklık sistemi meydan plak (biyofilm) ikamet ve geliştirmek için olanak sağlar. Periodontal hastalıkların 2 olarak adlandırılan bir durum – Sonuç olarak, enflamatuar yanıt, bazı durumlarda zararlı olur dişeti, gelişir. Temel olarak, plak indüklenen Periodontal patolojilerin gingivitis ve periodontitis ayrılabilir. Dişeti iltihabı dişeti ile sınırlı yerel inflamatuar yanıt bir geri durumu temsil eder. Periodontitis, diğer taraftan, geri dönüşü olmayan bir yıkıcı bir süreç olduğu bağlanma cihaz (alveol kemiği, periodontalbağ, sement ve diş eti) 3 yok edilir.
Dişeti periodontal hastalıklar 4 sırasında olduğu gibi efektör ve endüktif her iki site hizmet etmek için önerilmiştir. İnsan çalışmalar dental plak yanıt olarak, immün efektör hücreleri ve molekülleri dinamik sızmış veya kalkış dişeti 5-7 olduğunu ileri sürmüşlerdir. Bu aktivite, periodontal yıkım 8,9 önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. Insan dokuları ile çalışan, bu patolojik sürecin ilgili değerli bilgiler sağlanan çalışmalar tarafından oluşturulan veri büyük, etik, teknik ve deneysel sınırlamalar sahip ise. Transgenik fareler istihdam yoluyla ve in vivo müdahaleler 10 neden-sonuç deneylerine izin deneysel modellerin geliştirilmesi. Sonuç olarak, periodontal hastalık ile ilgili mekanizmalar bilgimizi son yirmi yılda önemli ölçüde artmıştır. Buna rağmen, periodontal hastalıkların karmaşıklığı nedeniyle, oradadoku yıkımı kolaylaştıran yerel immün yanıt niteliği ile ilgili devam eden bir tartışma. Periodontal hastalıklar sırasında dişeti merkezi bağışıklık hücrelerinin işlevini anlayışımızda eksikliği vardır. Bu hastalık, gingivanın hedef dokuda oluşan patolojik inflamatuar etkinliklerini inceleme amaçlı olarak bu nedenle çok önemlidir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tek bir fareden elde edilen üst çeneye gingival dokular, daha önce tarif edildiği gibi 1 hücre dışı ve hücre içi molekülleri ifade etmek için T ve B lenfositlerinin alt gruplar, hem de bunların özelliği analiz etmek için yeterlidir. Bununla birlikte, eğer nadir hücre popülasyonlarının (örneğin DC için) ilgilendiren, 2-3 fareler havuzu dokulara önerilir. Unutmayın ki, tercih, bu mümkündür sonra damak ve diş eti dokuları ve tüketim diş eti (adım 1.8-1.9 bir değişiklik) her ik…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma AW, AHH genç araştırmacılar (GIF Young) için Alman İsrail Vakfı ve Dr ben İsrail Bilim AHH için Vakfı (No 1418/11) ve (No 1933/12) hibe tarafından desteklenmiştir . AHH ve AW için Diş Hekimliği İbrani Üniversitesi-Hadassah Okulu'nda Cabakoff Araştırma Vakfı Fonu.
Materials
| Comments (optional) | Catalogue number | Company | Name of the reagent |
| CLS-2 | Worthington Biochemical Corp. | Collagenase Type II | |
| DN25-1G | SIGMA | DNAse I | |
| E6758-100G | SIGMA | EDTA | |
| D8537 | SIGMA | Dulbecco’s PBS | |
| Heat Inactivated | 04-121-1 | Biological Industries | Fetal Bovine Serum |
| FPE-204-500 | Jet Biofil | Vacuum-Driven Filter | |
| 352052 | BD Falcon | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | |
| 93070 | SPL Lifesciences | Cell Strainer 70 μm | |
| 153066 | NUNC | Tissue Culture Dish 35×10 mm | |
| 554714 | BD | BD Cytofix/Cytoperm | |
| Clone N418 | 117305 | Biolegend | Anti-mouse CD11c antibody |
| Clone 104 | 109819 | Biolegend | Anti-mouse CD45.2 antibody |
| Clone GK1.5 | 100413 | Biolegend | Anti-mouse CD4 antibody |
| Clone 53-6.7 | 100733 | Biolegend | Anti-mouse CD8a antibody |
| Clone 17A2 | 100214 | Biolegend | Anti-mouse CD3 antibody |
| Clone G8.8 | 118219 | Biolegend | Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody |
| Clone 929F3.01 | DDX0362D | Imgenex | Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody |
| Clone 39-10-8 | 115010 | Biolegend | Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody |
| BD Biosciences | LSR II Flow Cytometer | ||
| Tree Star | FlowJo Software v 7.6.5 |
References
- Arizon, M., et al. Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).
- Listgarten, M. A. Pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).
- Kinane, D. F. Causation and pathogenesis of periodontal disease. Periodontol. 25, 8-20 (2000).
- Jotwani, R., et al. Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies. J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).
- Graves, D. T., et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis. J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).
- Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues. Cytokine. 20, 70-77 (2002).
- Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation. J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).
- Cochran, D. L. Inflammation and bone loss in periodontal disease. J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).
- Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease. J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).
