בידוד, עיבוד וניתוח של תאי חניכיים Murine
Summary
מחקר זה מתאר טכניקה יעילה לבודד ולעבד את רקמות חניכיים מחלל הפה בעכבר על מנת לייצר תרבות מתא בודד. תאי כתוצאה מכך יכולים להיות בשימוש נוסף לניתוח cytometry זרימה ומחקרים מולקולריים.
Abstract
פיתחנו טכניקה לבודד בדיוק ולעבד את רקמת חניכיים עכברית עבור cytometry הזרימה ומחקרים מולקולריים. החניכיים היא רקמה ייחודית וחשובה ללמוד מנגנוני חיסון משום שהוא מעורב בתגובה החיסונית נגד מארח biofilm פה שעלול לגרום למחל חניכיים. יתר על כן, קרבתה של החניכיים לרקמת עצם מכתשיים מאפשרת גם לימוד שיפוץ עצם בתנאים דלקתיים. השיטה שלנו מניבה כמות גדולה של תאי מערכת חיסון, המאפשרת ניתוח של אוכלוסיות תאים נדירות אפילו כגון תאים לנגרהנס ותאי T רגולטוריים כפי שהוכחנו בעבר 1. עכברים המעסיקים ללמוד תגובות חיסוניות מקומיות מעורבות באיבוד עצם מכתשיים במחל חניכיים הוא יתרון בגלל הזמינות של כלים אימונולוגיים וניסיוני שונים. עם זאת, בשל גודלם הקטן והגישה נוחה יחסית לחניכיים העכבריות, מחקרים רבים נמנעו מבחינה של thiרקמה קריטית של. השיטה המתוארת בעבודה זו יכולה להקל על ניתוח חניכיים, אשר תהיה בתקווה להגדיל ממעיט על מערכת החיסון האוראלית ותפקידה במחל חניכיים.
Introduction
חניכיים היא רקמות רכות המקיפות את החלק הצווארי של השיניים ומכסה את תהליך מכתשיים (איור 1). החניכיים היא סוג של רירית לעיסה שניתן להפריד עוד יותר לתוך אפיתל הרירי ורקמת חיבור (הידוע גם בsubmucosa או propria lamina). המבנה האנטומי של החניכיים ושיניים סמוכות מאפשר לחיידקים לחיות ולפתח פלאק (biofilm) שכל הזמן מאתגר את המערכת החיסונית המקומית. כתוצאה מכך, מתפתחת תגובה דלקתית בחניכיים, אשר בנסיבות מסוימות הופכת להיות הרסני – מצב שמכונה מחלות חניכיים 2. בעיקרון, ניתן לחלק את פתולוגיות חניכיים המושרה פלאק לדלקת חניכיים וחניכיים. דלקת חניכיים מייצגת מצב הפיך של תגובה דלקתית המקומית שמוגבלת לחניכיים. חניכיים, ומצד שני, היא תהליך הרסני בלתי הפיך שבו מנגנון הקובץ המצורף (עצם מכתשיים, חניכייםרצועה, cementum וחניכיים) הוא נהרס 3.
החניכיים הוצעה לשרת אתרים גם מפעיל ואינדוקטיבי כמו במחל חניכיים 4. מחקרים בבני אדם הראו כי בתגובה לרובד שיניים, תאי מפעיל חיסוניים ומולקולות דינמי הסתננו או היציאה החניכיים 5-7. פעילות זו הוצגה לשחק תפקיד מרכזי בהרס חניכיים 8,9. אילו נתונים שנוצרו על ידי אותם מחקרים סיפק מידע בעל ערך רב לגבי התהליך הפתולוגי הזה, עבודה עם רקמות אדם בעל מגבלות אתיות, טכנית וניסיון גדולים. הפיתוח של מודלים ניסויים אפשרו experimentations סיבה ותוצאה באמצעות העסקת עכברים הטרנסגניים וin vivo התערבויות 10. כתוצאה מכך, הידע שלנו על המנגנונים המעורבים במחלת חניכיים גדל במידה ניכרת במהלך שני העשורים האחרונים. למרות זאת, בשל המורכבות של מחלות חניכיים, ישדיון מתמשך לגבי אופי התגובה חיסונית מקומית להקל הרס רקמות. יש גם חוסר בהבנה שלנו על התפקוד של תאי מערכת חיסון מרכזיים בחניכיים במהלך מחלות חניכיים. זה חיוני ובכך ללמוד אירועים פתולוגיים דלקתיים המתרחשים ברקמת היעד של המחלה, החניכיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
רקמות חניכיימיים לסת עליונות המתקבלות מעכבר אחת מספיקות לניתוח תת אוכלוסיות של לימפוציטים מסוג B וT, כמו גם היכולת שלהם להביע את המולקולות תאיות ו תאית כפי שתארנו בעבר 1. יחד עם זאת, אם אוכלוסיות תאים נדירות הן בעלי העניין (לדוגמא DCs), מומלץ לרקמות בריכת מ 2-3 עכברים…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדע (מס '1418-1411) לאהה ו( מס' 1933/12) לAW, הקרן גרמנית לחוקרים צעירים (GIF הצעיר) לאהה, ואני ד"ר . קרן תרומות מחקר Cabakoff בבית הספר לרפואת שיניים לאהה וAW-אוניברסיטת הדסה עברית.
Materials
| Comments (optional) | Catalogue number | Company | Name of the reagent |
| CLS-2 | Worthington Biochemical Corp. | Collagenase Type II | |
| DN25-1G | SIGMA | DNAse I | |
| E6758-100G | SIGMA | EDTA | |
| D8537 | SIGMA | Dulbecco’s PBS | |
| Heat Inactivated | 04-121-1 | Biological Industries | Fetal Bovine Serum |
| FPE-204-500 | Jet Biofil | Vacuum-Driven Filter | |
| 352052 | BD Falcon | 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | |
| 93070 | SPL Lifesciences | Cell Strainer 70 μm | |
| 153066 | NUNC | Tissue Culture Dish 35×10 mm | |
| 554714 | BD | BD Cytofix/Cytoperm | |
| Clone N418 | 117305 | Biolegend | Anti-mouse CD11c antibody |
| Clone 104 | 109819 | Biolegend | Anti-mouse CD45.2 antibody |
| Clone GK1.5 | 100413 | Biolegend | Anti-mouse CD4 antibody |
| Clone 53-6.7 | 100733 | Biolegend | Anti-mouse CD8a antibody |
| Clone 17A2 | 100214 | Biolegend | Anti-mouse CD3 antibody |
| Clone G8.8 | 118219 | Biolegend | Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody |
| Clone 929F3.01 | DDX0362D | Imgenex | Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody |
| Clone 39-10-8 | 115010 | Biolegend | Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody |
| BD Biosciences | LSR II Flow Cytometer | ||
| Tree Star | FlowJo Software v 7.6.5 |
References
- Arizon, M., et al. Langerhans cells down-regulate inflammation-driven alveolar bone loss. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 7043-7048 (2012).
- Listgarten, M. A. Pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 13, 418-430 (1986).
- Kinane, D. F. Causation and pathogenesis of periodontal disease. Periodontol. 25, 8-20 (2000).
- Jotwani, R., et al. Mature dendritic cells infiltrate the T cell-rich region of oral mucosa in chronic periodontitis: in situ, in vivo, and in vitro studies. J. Immunol. 167, 4693-4700 (2001).
- Graves, D. T., et al. Interleukin-1 and tumor necrosis factor antagonists inhibit the progression of inflammatory cell infiltration toward alveolar bone in experimental periodontitis. J. Periodontol. 69, 1419-1425 (1998).
- Kabashima, H., Yoneda, M., Nagata, K., Hirofuji, T., Maeda, K. The presence of chemokine (MCP-1, MIP-1alpha, MIP-1beta, IP-10, RANTES)-positive cells and chemokine receptor (CCR5, CXCR3)-positive cells in inflamed human gingival tissues. Cytokine. 20, 70-77 (2002).
- Moughal, N. A., Adonogianaki, E., Kinane, D. F. Langerhans cell dynamics in human gingiva during experimentally induced inflammation. J. Biol. Buccale. 20, 163-167 (1992).
- Cochran, D. L. Inflammation and bone loss in periodontal disease. J. Periodontol. 79, 1569-1576 (2008).
- Taubman, M. A., Valverde, P., Han, X., Kawai, T. Immune response: the key to bone resorption in periodontal disease. J. Periodontol. 76, 2033-2041 (2005).
- Graves, D. T., Kang, J., Andriankaja, O., Wada, K., Rossa, C. Animal models to study host-bacteria interactions involved in periodontitis. Front Oral Biol. 15, 117-132 (2012).
