Summary

Isolation, Verarbeitung und Analyse von Murine Gingivazellen

Published: July 02, 2013
doi:

Summary

Diese Studie beschreibt ein effizientes Verfahren zur Isolation und Behandlung Gingiva von der Maus Mundhöhle, um eine Einzelzellen-Kultur zu erzeugen. Die resultierenden Zellen können weiter für die Durchflusszytometrie und molekulare Studien eingesetzt werden.

Abstract

Wir haben eine Technik entwickelt, um genau zu isolieren und zu verarbeiten Maus Zahnfleisch für die Durchflusszytometrie und molekularbiologische Studien entwickelt. Das Zahnfleisch ist eine einzigartige und wichtige Gewebe Immunmechanismen zu studieren, weil es in Immunantwort gegen orale Biofilme, die Parodontalerkrankungen führen könnten beteiligt ist. Darüber hinaus ermöglicht die Nähe des Zahnfleisches zu Alveolarknochen Gewebe auch das Studium Knochenumbau unter entzündlichen Bedingungen. Unsere Methode liefert große Mengen von Immunzellen, die Analyse selbst seltenen Zellpopulationen wie Langerhans-Zellen und regulatorischen T-Zellen ermöglicht, wie wir bereits gezeigt, 1. Verwendung Mäusen zu lokalen Immunreaktionen in Alveolarknochenschwund bei Parodontopathien beteiligt studieren ist aufgrund der Verfügbarkeit von verschiedenen immunologischen und experimentelle Werkzeuge vorteilhaft. Allerdings lassen sich aufgrund ihrer geringen Größe und der relativ unbequem Zugang zum murinen Zahnfleisch, vermieden viele Studien Prüfung von this kritischen Gewebe. Das Verfahren in dieser Arbeit beschriebenen erleichtern könnte gingivalen Analyse, die hoffentlich unsere Unterbewertung auf die orale Immunsystem und seine Rolle während der Parodontalerkrankungen wird zunehmen.

Introduction

Gingiva ist das weiche Gewebe um den zervikalen Teil der Zähne und deckt den Alveolarfortsatz (Abbildung 1). Das Zahnfleisch ist eine Art von Kau-Mukosa, die weiter in Schleimhaut-Epithel und Bindegewebe (auch als Submukosa oder Lamina propria bekannt) getrennt werden können. Die anatomische Struktur des Zahnfleisches und der angrenzenden Zähne ermöglicht es Bakterien, leben und entwickeln Plaque (Biofilm), die ständig herausfordert die lokale Immunsystem. Als ein Ergebnis entwickelt Entzündungsreaktion in der Gingiva, die unter Umständen gesundheitsschädlich wird – ein Zustand bezeichnet Parodontopathien 2. Grundsätzlich kann Plaque-induzierte parodontalen Erkrankungen in Gingivitis und Parodontitis unterteilt werden. Gingivitis eine reversible Zustand der lokalen Entzündungsreaktion, die das Zahnfleisch beschränkt ist. Periodontitis, auf der anderen Seite, ist eine irreversible zerstörende Verfahren, bei dem die Befestigungsvorrichtung (Alveolarknochen periodontalenLig. Zement und Zahnfleisch) ist 3 zerstört.

Das Zahnfleisch wurde vorgeschlagen, sowohl als Effektor und induktive Websites während Parodontalerkrankungen 4 dienen. Menschliche Studien haben vorgeschlagen, dass als Reaktion auf Zahnbelag, Immuneffektorzellen und Moleküle dynamisch infiltriert oder Abreise das Zahnfleisch 5-7. Diese Aktivität wurde gezeigt, dass eine wichtige Rolle bei der parodontalen Zerstörung 8,9 spielen. Während Daten von diesen Studien lieferten wertvolle Informationen über diesen pathologischen Prozess, die Arbeit mit menschlichen Geweben erzeugt besitzen erhebliche ethische, technische und experimentelle Einschränkungen. Die Entwicklung von experimentellen Modellen erlaubt Ursache-Wirkungs-Experimente über den Einsatz transgener Mäuse und in vivo Interventionen 10. Dadurch erhöht unser Wissen über die Mechanismen in Parodontitis beteiligt sich während der letzten zwei Jahrzehnte. Trotzdem aufgrund der Komplexität der periodontalen Krankheiten bestehteine Debatte über die Art der lokalen Immunantwort Erleichterung Gewebezerstörung. Es ist auch ein Mangel in unserem Verständnis von der Funktion des zentralen Immunzellen in das Zahnfleisch während Parodontalerkrankungen. Es ist somit wesentlich, pathologische entzündliche Ereignisse in das Zielgewebe von der Krankheit, der Gingiva zu studieren.

Protocol

Bereiten Sie im Voraus: PBS + 2% FCS PBS + 2% FCS mit 2 mg / ml Kollagenase Typ II und 1 mg / ml DNAse Typ I (1 ml pro Probe) Sterilisiert chirurgische Instrumente 0,5 M EDTA-Lösung 1. Obere Gingival Exzision Technik Euthanize Mäusen mit zugelassenen IACUC Führung. Schneiden Sie beide Seiten der Mundhöhle, einschließlich der Wangen und des Unterkiefers Ramus mit einem spitz / stumpf gerade Schere. Ziehen Sie…

Representative Results

Beispiele für Durchflusszytometrie-Analyse auf Gingivazellen vorgestellt. Gingival Zellen aus 2 Mäuse wurden vereinigt in einem LSR II Durchflusszytometer laufen und unter Verwendung FlowJo Software. 3A demonstriert die Verteilung der gingivalen Zellen aus naiven Mäusen in einer Seitwärts-Streulicht (SSC) gegen forward scatter (FSC) Grundstück. Gating Strategie zur Identifizierung (i) Lymphozyten (ii) Monozyten / dendritische Zellen und (iii) Granulozyten angegeben. Zum Vergleich dazu präsentieren…

Discussion

Oberkiefer Zahnfleischgeweben aus einem einzigen Mausklick erhalten sind ausreichend für die Analyse von Sub-Populationen von T-und B-Lymphozyten, sowie ihre Fähigkeit, extra-und intrazellulären Molekülen auszudrücken, wie wir zuvor beschrieben 1. Dennoch, wenn seltenen Zellpopulationen von Interesse sind (z. B. DCs), wird es in Pool Geweben 2-3 Mäuse empfohlen. Zu beachten ist, wenn bevorzugt, ist es möglich, sowohl den Gaumen schälen und Zahnfleischgeweben und dann der Verbrauchsteuer das Zahnfleisc…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse aus der Israel Science Foundation (Nr. 1418/11) an und AHH (Nr. 1933-1912) zu AW, der Deutsch-Israelischen Stiftung für junge Forscher (GIF Young) zu AHH, und die Dr. I unterstützt . Cabakoff Forschung Endowment Fund an der Hebrew University-Hadassah School of Dental Medicine, um AHH und AW.

Materials

Comments (optional) Catalogue number Company Name of the reagent
CLS-2 Worthington Biochemical Corp. Collagenase Type II
DN25-1G SIGMA DNAse I
E6758-100G SIGMA EDTA
D8537 SIGMA Dulbecco’s PBS
Heat Inactivated 04-121-1 Biological Industries Fetal Bovine Serum
FPE-204-500 Jet Biofil Vacuum-Driven Filter
352052 BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube
93070 SPL Lifesciences Cell Strainer 70 μm
153066 NUNC Tissue Culture Dish 35×10 mm
554714 BD BD Cytofix/Cytoperm
Clone N418 117305 Biolegend Anti-mouse CD11c antibody
Clone 104 109819 Biolegend Anti-mouse CD45.2 antibody
Clone GK1.5 100413 Biolegend Anti-mouse CD4 antibody
Clone 53-6.7 100733 Biolegend Anti-mouse CD8a antibody
Clone 17A2 100214 Biolegend Anti-mouse CD3 antibody
Clone G8.8 118219 Biolegend Anti-mouse CD326 (Ep-CAM) antibody
Clone 929F3.01 DDX0362D Imgenex Anti-mouse CD207 (Langerin) antibody
Clone 39-10-8 115010 Biolegend Anti-mouse I-Ad (MHC-II) antobody
BD Biosciences LSR II Flow Cytometer
Tree Star FlowJo Software v 7.6.5

References

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Cite This Article
Mizraji, G., Segev, H., Wilensky, A., Hovav, A. Isolation, Processing and Analysis of Murine Gingival Cells. J. Vis. Exp. (77), e50388, doi:10.3791/50388 (2013).

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