המפרט של נוירונים glutamatergic Telencephalic מתאי גזע pluripotent אדם
Summary
הליך זה מניב נוירונים telencephalic על ידי עובר מחסומים שדומים לאלו שנצפו בהתפתחות האנושית. התאים מותרים באופן ספונטני כדי להבדיל, חשופים לגורמים שדוחפים אותם לכיוון השושלת העצבית, מבודדים, ומצופים על coverslips כדי לאפשר בידול מסוף והתבגרות.
Abstract
כאן, הליך הדרגתי ליצירת נוירונים glutamatergic telencephalic מתאי גזע pluripotent אדם (PSCs) יעילות שתואר. תהליך הבידול הוא יזם על ידי שבירת PSCs האדם לתוך גושים שמכתרים את טופס אגרגטים כאשר התאים מוקם בתרבות השעיה. המצרפים אז הם גדלו במדיום hESC מימים 1-4 לאפשר לבידול ספונטני. במהלך תקופה זו, את התאים יש את היכולת להפוך כל אחת משלוש השכבות הניבטות. מימים 5-8, את התאים מוקם בהשראה עצבית בינוני לדחוק אותם לשושלת העצבית. סביב היום 8, התאים מותר לצרף אל 6 גם צלחות ולהבחין שבמהלך הזמן את צורת תאי neuroepithelial. תאים אלה neuroepithelial יכולים להיות מבודדים ביום 17. התאים לאחר מכן ניתן לשמור אותו כneurospheres עד שהם מוכנים להיות מצופים על coverslips. שימוש באמצעי בסיסי ללא כל גורמי caudalizing, תאי neuroepithelial הם specifieד למבשרי telencephalic, שאז יכול להיות מובחן יותר לתוך אבות telencephalic גב ונוירונים glutamatergic יעילות. בסך הכל, המערכת שלנו מספקת כלי ליצירת נוירונים glutamatergic אדם לחוקרים ללמוד פיתוח של הנוירונים האלה ואת המחלות שמשפיעות עליהם.
Introduction
תאי גזע pluripotent אדם (PSCs), כוללים שני תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ותאי גזע pluripotent מושרים (iPSCs), יש את היכולת לייצר כל סוג תא בגוף, כוללים תאי עצב 1-3. בידול מכוון של תת עצבי שונים מPSCs אדם מחזיק את המפתח ליישום של תאים אלה ברפואת רגנרטיבית. הדור של תת עצבי פונקציונלי במהלך פיתוח הוא תהליך מורכב כרוכים בגיוס של שושלת עצבית, מפרט של אבות אזוריים לאורך ציר rostro-הזנב, ובידול של סוגי תאי עצב לאחר mitotic מאבות 4.5 האזוריים. החל משנת 2001, מספר מערכות שהוקמו כדי ליצור שושלת עצבית מhESCs, שספק פלטפורמת לדור הבא של תת עצבי 6,7. בהתבסס על עקרונות התפתחותיים, סוגים שונים של תאי עצב מוטורי כגון תאי עצב שדרה 8-12, המוח התיכון DOPהנוירונים aminergic 13-15, ותאי רשתית עצבי 16,17 כבר צוינו ביעילות מPSCs אדם. הדבר נעשה על ידי יישום morphogens הקריטי חשובים למפרט של סוגי תאי עצב אלו במהלך התפתחות בגוף חייה. פרוטוקולים אחרים יש גם פותח כדי לקדם את הבידול של hESCs לנוירונים או באמצעות גורמים נוספים כגון 18-20 מולקולות קטנות או על ידי שיתוף culturing עם סוגי תאים אחרים כדי לעזור לקדם את הבידול 21.
הניאוקורטקס האנושי מפותח מאוד ומכיל סוגים רבים של תאים, כולל תאי עצב glutamatergic אשר משחקים תפקיד חשוב בלמידה, זיכרון ותפקוד הקוגניטיבי 22,23. הצעד הראשון ביצירת נוירונים glutamatergic בתרבות הוא לציין בתאים telencephalic. הקבוצה של Yoshiki Sasai דיווחה בידול המכוון של מבשרי telencephalic מעכבר ESCs (mESCs) באמצעות suspensio הסרום ראשון חינםתרבות n בנוכחות DKK1 (אשר מעכב איתות Wnt) כמו גם LeftyA (אשר מעכב קטרי איתות) 24. כתוצאה מכך, מספר קבוצות כולל זו שלנו גם דיווחו על המפרט של מבשרי telencephalic מPSCs אדם בללא בינוני 25-27 סרום. הדור של מבשרי telencephalic מPSCs אדם אינו דורש השימוש בmorphogens אקסוגניים והיעיל ביצירת המקדמים הללו הוא הרבה יותר גבוה מזה מmESCs 26,27. כאן, מערכת הגדרה כימית לזירוז עצבי שהוקם גם על ידי קבוצתו של ג'אנג 7 כבר תארה. ללא תוספת של גורמים אקסוגניים caudalizing, פרוטוקול זה יעיל מייצר מבשרי telencephalic מPSCs אדם 27. אבות אלה לאחר מכן ניתן מובחנים לאבות הגבו או גחון על ידי ויסות האיתות של Wnt וסוניק קיפוד (שש). את אבות הגב עוד יכולים להתמיין לתאי עצב דואר glutamatergicfficiently 27. בנוסף, פרוטוקול זה גם עובד היטב עבור הדור של נוירונים glutamatergic מ28 iPSCs האנושי, המאפשר לדור של נוירונים מטופל ספציפיים שיכול להיות מנוצל כדי לחקור את מנגנון הפעולה, כמו גם טיפולים פוטנציאליים למגוון רחב של מחלות . יתר על כן, המערכת שלנו מספקת גם פלטפורמה כדי לחקור את הפיתוח ואת המפרט של סוגים עצביים מגוונים בtelencephalon.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מספר שלבים קריטיים בתהליך ההתמיינות העצבי. חשוב להבטיח שהאדם הוא PSCs pluripotent כי כבר עלולים להיות מוטים באופן אחר את התאים לקראת הפיכת שושלת שאינה עצבית. זה יכול להיות מאושר על ידי מכתים את PSCs האדם עם נוגדנים נגד סמני pluripotency כגון Oct4, Sox2, Nanog, וTra-1-60 1-3. אם PSCs האדם ל…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לד"ר י Sasai למתן נוגדן FOXG1 בנדיבות. עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר בתאי גזע קונטיקט (08-SCB-UCHC- 022 ו 11-SCB24) וקרן Paraplegia ספסטי.
Materials
| Reagent | Supplier | Catalog # |
| Dulbecco’s modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Gibco | 11330-032 |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | 10828-028 |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | 25030 |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 1140-050 |
| 2-Mercaptoethanol (14.3 M) | Sigma | M-7522 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
| N2 | Gibco | 17502-048 |
| B27 | Gibco | 12587-010 |
| Heparin | Sigma | H3149 |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine) | Sigma | 116K5103 |
| Laminin (human) | Sigma | L-6274 |
| Laminin (mouse) | Invitrogen | 23017-015 |
| FBS | Gemini | 100-106 |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 |
| Dispase | Gibco | 17105-041 |
| Collagenase | Invitrogen | 17104-019 |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 |
| ROCK Inhibitor | Stemgent | 04-0012 |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Invitrogen | 13256-029 |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075 |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B |
| Foxg1 antibody | Dr. Y. Sasai | |
| Hoxb4 antibody (1:50) | Developmental Studies Hybridoma Bank | I12 |
| Pax6 antibody (1:5000) | Developmental Studies Hybridoma Bank | PAX6 |
| Nkx2.1 antibody (1:200) | Chemicon | MAB5460 |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 |
| vGLUT1 antibody (1:100) | Synaptic Systems | 135302 |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | PrepoTech Inc. | 450-02 |
| Glial derived neurotrophic factor (GDNF) | PrepoTech Inc. | 450-10 |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | PrepoTech Inc. | 100-11 |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | D-0260 |
| Sonic hedgehog (SHH) | R&D | 1845-SH |
| 50 ml tubes | Becton Dickinson (BD) | 352098 |
| 15 ml tubes | BD | 352097 |
| 6 well plates | BD | 353046 |
| 24 well plates | BD | 353047 |
| T25 flasks (untreated) | BD | 353009 |
| T75 flasks (untreated) | BD | 353133 |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 |
| 6 cm Petri dishes | BD | 353004 |
| 9” glass pipetes | Fisher | 13-678-20D |
| Steriflip filters (0.22 μM) | Millipore | SCGP00525 |
| Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM) | Millipore | SCGPU10RE |
| Phase contrast microscope (Observer A1) | Zeiss | R2625 |
| Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150) | Thermo Electron Corporation | |
| Biosafety hood (Sterilgard III Advance) | The Baker Company | |
| Centrifuge (5702 R) | Eppendorf |
References
- Takahashi, K., Tanabe, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes. Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).
- Wilson, S. I., Edlund, T. Neural induction: toward a unifying mechanism. Nat. Neurosci. 4, 1161-1168 (2001).
- Reubinoff, B. E., Itsykson, P., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
- Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).
- Hu, B. Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).
- Singh Roy, N., Nakano, T., et al. Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells. Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).
- Lee, H., Shamy, G. A., et al. Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons. Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).
- Boulting, G. L., Kiskinis, E., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29, 279-286 (2011).
- Li, X. J., Du, Z. W., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
- Perrier, A. L., Tabar, V., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).
- Roy, N. S., Cleren, C., et al. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat Med. 12, 1259-1268 (2006).
- Yan, Y., Yang, D., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
- Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16698-16703 (2009).
- Osakada, F., Ikeda, H., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
- Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells. Exp. Neurol. 172, 383-397 (2001).
- Chambers, S. M., Fasano, C. A., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Chambers, S. M., Qi, Y., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nat. Biotechnol. 30, 715-720 (2012).
- Kawasaki, H., Mizuseki, K., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
- Rubenstein, J. L., Beachy, P. A. Patterning of the embryonic forebrain. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 18-26 (1998).
- Hevner, R. F., Hodge, R. D., Daza, R. A., Englund, C. Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus. Neurosci. Res. 55, 223-233 (2006).
- Watanabe, K., Kamiya, D., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).
- Watanabe, K., Ueno, M., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Pankratz, M. T., Li, X. J., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
- Li, X. J., Zhang, X., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136, 4055-4063 (2009).
- Zeng, H., Guo, M., et al. Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 5, e11853 (2010).
- Kim, D. S., Lee, J. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev. 6, 270-281 (2010).
- Zhang, X., Huang, C. T., et al. Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell. 7, 90-100 (2010).
- Stern, C. D. Initial patterning of the central nervous system: how many organizers. Nat. Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).
- Ma, L., Hu, B., et al. Human embryonic stem cell-derived GABA neurons correct locomotion deficits in quinolinic acid-lesioned mice. Cell Stem Cell. 10, 455-464 (2012).
- Li, W., Wei, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
- Lowry, W. E., Richter, L., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321, 1218-1221 (2008).
- Ebert, A. D., Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).
- Kiskinis, E., Eggan, K. Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells. J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).
- Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation. Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).
- Walsh, R. M., Hochedlinger, K. Modeling Rett syndrome with stem cells. Cell. 143, 499-500 (2010).
- Egawa, N., Kitaoka, S., et al. Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates. Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).
