De Specificatie van Telencephalic glutamaat neuronen van menselijke pluripotente stamcellen
Summary
Deze procedure levert telencephalic neuronen door door checkpoints die vergelijkbaar zijn met die waargenomen in menselijke ontwikkeling. De cellen mogen spontaan differentiëren blootgesteld aan risicofactoren te duwen naar de neurale stam, geïsoleerd en uitgeplaat op dekglaasjes om voor terminale differentiatie en maturatie.
Abstract
Hier is een stapsgewijze procedure voor het efficiënt genereren telencephalic glutamaat neuronen van menselijke pluripotente stamcellen (PSC) beschreven. Het differentiatieproces wordt geïnitieerd door het breken van de menselijke loketten tot klonten die afgerond naar aggregaten wanneer de cellen worden geplaatst in een suspensiekweek. De aggregaten worden vervolgens gekweekt in medium hESC van dag 1-4 om voor spontane differentiatie. Gedurende deze tijd de cellen hebben het vermogen te worden elk van de drie kiembladen. Vanaf dag 5-8, werden de cellen in een neurale inductie medium te duwen in de neurale lineage. Rond dag 8 worden de cellen mag hechten op 6 well platen en gedurende welke tijd de cellen neuro vorm differentiëren. Deze neuro cellen kunnen worden geïsoleerd op dag 17. De cellen worden gehouden als neurosferen tot ze gereed zijn uitgeplaat op dekglaasjes. Met behulp van een basisch milieu, zonder enige caudalizing factoren, neuro-epitheliale cellen zijn specified in telencephalic voorlopers, die vervolgens verder kunnen worden onderscheiden in dorsale telencephalic voorouders en glutamaat neuronen efficiënt. Algemeen ons systeem een hulpmiddel om menselijke glutamaat neuronen voor onderzoekers genereren om de ontwikkeling van deze neuronen en de ziekten die hen beïnvloeden bestuderen.
Introduction
Menselijke pluripotente stamcellen (PSC), zowel menselijke embryonale stamcellen (hESC ') en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs), de capaciteit om elk celtype in het lichaam, waaronder neuronen 1-3 genereren. Gerichte differentiatie van verschillende neuronale subtypes van menselijke PSC heeft de sleutel voor de toepassing van deze cellen in de regeneratieve geneeskunde. De productie van functionele neuronale subtypes tijdens ontwikkeling een complex proces, waarbij de inductie van neurale stam, de specificatie van regionale progenitors langs de rostro-caudale as en de differentiatie van post-mitotische neuronen types van de regionale progenitoren 4,5. Vanaf 2001 zijn er verschillende systemen opgezet om neurale afstamming genereren uit hESC 's, die een platform hebben voor de volgende generatie van neuronale subtypes 6,7. Op basis ontwikkelingsprincipes verschillende types neuron zoals spinale motorische neuronen 8-12, midbrain dopaminerge neuronen 13-15, en neurale retinale cellen 16,17 zijn efficiënt opgegeven vanaf het menselijk PSC's. Dit werd gedaan door kritische morfogenen die belangrijk zijn voor de specificatie van deze types neuron tijdens in vivo ontwikkeling. Andere protocollen zijn ook ontwikkeld om de differentiatie van hESC 'via in neuronen met behulp van aanvullende factoren 18-20 zoals kleine moleculen of co-kweken met andere celtypen om differentiatie 21 bevorderen.
De menselijke neocortex is sterk ontwikkeld en bevat vele soorten cellen, met inbegrip van glutamaat neuronen die een belangrijke rol bij het leren, het geheugen en cognitieve functies 22,23 af te spelen. De eerste stap in het genereren glutamaterge neuronen in cultuur te geven telencephalic progenitorcellen. Yoshiki Sasai groep voor het eerst gemeld de gerichte differentiatie van telencephalic voorlopers van muis SER (mESCs) met behulp van een serum-vrij suspension kweken in aanwezigheid van Dkk1 (die remt Wnt signalering) en LeftyA (die remt nodale signalering) 24. Vervolgens hebben verschillende groepen waaronder ons rapporteerden ook de specificatie van telencephalic precursors uit humaan PSC in serumvrij medium 25-27. De generatie van telencephalic precursors van menselijke PSC vereist niet het gebruik van exogene morfogenen en de efficiëntie in het genereren van deze precursors is veel hoger dan van mESCs 26,27. Hier is een chemisch welbepaalde systeem voor neurale inductie die goed werd opgericht door de groep Zhang's 7 is beschreven. Zonder de toevoeging van exogene caudalizing factoren, dit protocol genereert efficiënt telencephalic voorlopers van menselijke PSC's 27. Deze voorlopers kunnen dan worden onderscheiden in dorsale of ventrale voorouders door het reguleren van de signalering van Wnt en sonic hedgehog (SHH). De dorsale voorouders kan verder differentiëren in glutamaat neuronen efficiently 27. Daarnaast heeft dit protocol werkt ook goed voor het genereren van glutamaat neuronen van menselijke iPSCs 28, waardoor het genereren van patiëntspecifieke neuronen die kunnen worden gebruikt om het werkingsmechanisme en potentiële therapieën voor een groot scala aan ziekten verkennen . Bovendien ons systeem biedt ook een platform voor de ontwikkeling en specificatie van diverse types neuronale in het telencephalon verkennen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn verschillende kritische stappen tijdens het neurale differentiatieproces. Het is belangrijk dat de menselijke loketten pluripotent zijn omdat anders de cellen al voorgespannen richting van een niet-neuronale oorsprong. Dit wordt bevestigd door het kleuren van de menselijke loketten met antilichamen tegen pluripotentie markers zoals Oct4, SOX2, NANOG en Tra-1-60 1-3. Als de menselijke PSC's niet goed hechten na passage hen kan ROCK inhibitor (Y27632) worden toegevoegd om te helpen. Voor diegenen di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Dr Y. Sasai bedanken voor royaal verstrekken van de FOXG1 antilichaam. Dit werk werd ondersteund door Connecticut Stem Cell Research Grants (08-SCB-UCHC- 022 en 11-SCB24) en spastische paraplegie Foundation.
Materials
| Reagent | Supplier | Catalog # |
| Dulbecco’s modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12) | Gibco | 11330-032 |
| Knockout Serum Replacer | Gibco | 10828-028 |
| L-glutamine (200 mM) | Gibco | 25030 |
| Non Essential Amino Acids | Gibco | 1140-050 |
| 2-Mercaptoethanol (14.3 M) | Sigma | M-7522 |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 |
| N2 | Gibco | 17502-048 |
| B27 | Gibco | 12587-010 |
| Heparin | Sigma | H3149 |
| Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine) | Sigma | 116K5103 |
| Laminin (human) | Sigma | L-6274 |
| Laminin (mouse) | Invitrogen | 23017-015 |
| FBS | Gemini | 100-106 |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A-7906 |
| Dispase | Gibco | 17105-041 |
| Collagenase | Invitrogen | 17104-019 |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 |
| ROCK Inhibitor | Stemgent | 04-0012 |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010 |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF) | Invitrogen | 13256-029 |
| Trypsin inhibitor | Gibco | 17075 |
| 0.1% gelatin | Millipore | ES-006-B |
| Foxg1 antibody | Dr. Y. Sasai | |
| Hoxb4 antibody (1:50) | Developmental Studies Hybridoma Bank | I12 |
| Pax6 antibody (1:5000) | Developmental Studies Hybridoma Bank | PAX6 |
| Nkx2.1 antibody (1:200) | Chemicon | MAB5460 |
| Tbr1 antibody (1:2000) | Chemicon | AB9616 |
| vGLUT1 antibody (1:100) | Synaptic Systems | 135302 |
| Brain derived neurotrophic factor (BDNF) | PrepoTech Inc. | 450-02 |
| Glial derived neurotrophic factor (GDNF) | PrepoTech Inc. | 450-10 |
| Insulin growth factor 1 (IGF1) | PrepoTech Inc. | 100-11 |
| Cyclic AMP (cAMP) | Sigma | D-0260 |
| Sonic hedgehog (SHH) | R&D | 1845-SH |
| 50 ml tubes | Becton Dickinson (BD) | 352098 |
| 15 ml tubes | BD | 352097 |
| 6 well plates | BD | 353046 |
| 24 well plates | BD | 353047 |
| T25 flasks (untreated) | BD | 353009 |
| T75 flasks (untreated) | BD | 353133 |
| Coverslips | Chemiglass Life Sciences | 1760-012 |
| 6 cm Petri dishes | BD | 353004 |
| 9” glass pipetes | Fisher | 13-678-20D |
| Steriflip filters (0.22 μM) | Millipore | SCGP00525 |
| Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM) | Millipore | SCGPU10RE |
| Phase contrast microscope (Observer A1) | Zeiss | R2625 |
| Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150) | Thermo Electron Corporation | |
| Biosafety hood (Sterilgard III Advance) | The Baker Company | |
| Centrifuge (5702 R) | Eppendorf |
References
- Takahashi, K., Tanabe, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
- Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes. Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).
- Wilson, S. I., Edlund, T. Neural induction: toward a unifying mechanism. Nat. Neurosci. 4, 1161-1168 (2001).
- Reubinoff, B. E., Itsykson, P., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
- Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).
- Hu, B. Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).
- Singh Roy, N., Nakano, T., et al. Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells. Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).
- Lee, H., Shamy, G. A., et al. Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons. Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).
- Boulting, G. L., Kiskinis, E., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29, 279-286 (2011).
- Li, X. J., Du, Z. W., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
- Perrier, A. L., Tabar, V., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).
- Roy, N. S., Cleren, C., et al. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat Med. 12, 1259-1268 (2006).
- Yan, Y., Yang, D., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
- Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16698-16703 (2009).
- Osakada, F., Ikeda, H., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
- Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells. Exp. Neurol. 172, 383-397 (2001).
- Chambers, S. M., Fasano, C. A., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Chambers, S. M., Qi, Y., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nat. Biotechnol. 30, 715-720 (2012).
- Kawasaki, H., Mizuseki, K., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
- Rubenstein, J. L., Beachy, P. A. Patterning of the embryonic forebrain. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 18-26 (1998).
- Hevner, R. F., Hodge, R. D., Daza, R. A., Englund, C. Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus. Neurosci. Res. 55, 223-233 (2006).
- Watanabe, K., Kamiya, D., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).
- Watanabe, K., Ueno, M., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Pankratz, M. T., Li, X. J., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
- Li, X. J., Zhang, X., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136, 4055-4063 (2009).
- Zeng, H., Guo, M., et al. Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 5, e11853 (2010).
- Kim, D. S., Lee, J. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev. 6, 270-281 (2010).
- Zhang, X., Huang, C. T., et al. Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell. 7, 90-100 (2010).
- Stern, C. D. Initial patterning of the central nervous system: how many organizers. Nat. Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).
- Ma, L., Hu, B., et al. Human embryonic stem cell-derived GABA neurons correct locomotion deficits in quinolinic acid-lesioned mice. Cell Stem Cell. 10, 455-464 (2012).
- Li, W., Wei, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
- Lowry, W. E., Richter, L., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
- Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321, 1218-1221 (2008).
- Ebert, A. D., Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).
- Kiskinis, E., Eggan, K. Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells. J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).
- Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation. Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).
- Walsh, R. M., Hochedlinger, K. Modeling Rett syndrome with stem cells. Cell. 143, 499-500 (2010).
- Egawa, N., Kitaoka, S., et al. Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates. Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).
