הקלטת פעילות חשמלי מתא העצב מזוהה במוח שלם של דג מהונדס
Summary
בסרטון הזה, נדגים כיצד להקליט פעילות חשמלית מתא עצב בודד שזוהה בכל הכנת מוח, השומרת על מעגלים עצביים מורכבים. אנו משתמשים בדג מהונדס שבי גונדוטרופין משחרר הורמון (GnRH) נוירונים מתויגים גנטי בחלבון פלואורסצנטי לזיהוי בהכנת המוח השלמה.
Abstract
הבנת הפיסיולוגיה של התא של מעגלים עצביים המווסתים את ההתנהגויות מורכבות היא מאוד משופרת באמצעות מערכות מודל שבו ניתן לבצע את העבודה הזאת בהכנת מוח שלמה שבו המעגלים העצביים של מערכת העצבים המרכזית נשארים שלמים. אנו משתמשים בדג מהונדס שבי גונדוטרופין משחרר הורמון (GnRH) נוירונים מתויגים גנטי עם חלבון פלואורסצנטי ירוק לזיהוי במוח שלם. יש דגי אוכלוסיות מרובות של נוירונים GnRH, והפונקציות שלהם הן תלויות במיקומם במוח ובגן GnRH שהם מביעים 1. יש לנו התמקדנו בהפגנה שלנו GnRH3 נוירונים הממוקמים בעצבי המסוף (TN) בקשר לנורות חוש הריח באמצעות המוח שלם של דגי medaka מהונדס (איור 1B ו-C). מחקרים מראים שנוירונים TN-GnRH3 Medaka הם neuromodulatory, מתנהגים כמו משדר של מידע מהסביבה החיצונית למערכת העצבים המרכזית; לאהיי לא משחק תפקיד ישיר בויסות תפקודי יותרת המוח, האשכים, כפי שעושה נוירונים ההיפותלמוס GnRH1 הידועים 2, 3. דפוס טוניק של ירי פוטנציאל פעולה הספונטני של תאי עצב TN-GnRH3 הוא מאפיין מהותי 4-6, התדירות מתוכם הוא מווסת על ידי רמזים חזותיים מקונספציפים 2 ו kisspeptin 1 5 נוירופפטידים. בסרטון הזה, אנו משתמשים בקו יציב של מהונדס medaka בי נוירונים TN-GnRH3 להביע transgene המכיל את האזור המקדם של Gnrh3 קשור לחלבון פלואורסצנטי ירוק משופר 7 להראות לך איך לזהות ולעקוב אחר פעילות נוירונים החשמלית שלהם במוח כולו הכנת 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
GnRH 3: דגים מהונדסים GFP לספק מודלים ייחודיים כדי לחקור את המנגנונים שבבסיס neurophysiological אינטגרציה ורגולציה בשליטה מרכזית של התנהגויות שהן גם ישירות ובעקיפין מעורבות ב3 רבייה, 8-10 עצביים. אחד היתרונות המשמעותיים של מערכת מודל זה הוא שהרבה GnRH3 נוירונים להביע GFP קר?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר מנג-צ'ין לין וגב 'דונג יואן לקבלת סיוע טכני. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי לבריאות HD053767 (קבלנות משנה לNLW), ועל ידי קרנות מהמחלקה לפיסיולוגיה ומשרד המשנה לנגיד למחקר, אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס (NLW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX50W (Upright) | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 200B | |
| A-D converter | Computer Interference Corp. | Digidata ITC-18 | |
| Cooled CCD camera | PCO Computer Optics | Sensicam | |
| Xenon lamp | Sutter Instruments Co. | ||
| GFP filter set | Chroma Technologies | ||
| Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | Slidebook software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | Axon Instruments | Axograph software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | AD Instruments Inc. | PowerLab | |
| Headstage for electrophysiology | Axon Instruments | CV 203BU | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-285 | |
| Recording Chamber Platform | Warner Instrument Corp. | P1 | |
| Recording Chamber | Warner Instrument Corp. | RC-26G | |
| Electrode Puller | Sutter instruments | P87 | |
| Filament for electrode puller | Sutter Instruments | FB330B | 3.0 mm wide trough filament |
| 1.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | Microelectrode for recording |
| Syringe | Becton Dickinson | 309586 | 3 ml |
| MS-222 | Sigma | E10521-10G | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
| Fish saline | mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES | ||
| Electrode solution (loose-patch) | mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose | ||
| Electrode solution (whole-cell patch) | mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine |
References
- Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom. J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).
- Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).
- Abe, H., Oka, Y. Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost. 57 (6), 665-674 (2011).
- Oka, Y. Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones. J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).
- Zhao, Y., Wayne, N. L. Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka. PLoS One. 7 (5), e37909 (2012).
- Wayne, N. L., et al. Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes). Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).
- Okubo, K., et al. Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
- Okubo, K., et al. A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).
- Ramakrishnan, S., et al. Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio). Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).
- Abraham, E., et al. Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction. Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).
- Wayne, N. L., Kuwahara, K. Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes. Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).
- Oka, Y. Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts. J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).
- Molleman, A. . Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , (2003).
