Summary

La registrazione dell'attività elettrica dai neuroni identificati nel cervello intatto di pesci transgenici

Published: April 30, 2013
doi:

Summary

In questo video, dimostreremo come registrare l'attività elettrica di singoli neuroni identificati in una preparazione cervello intero, che preserva i circuiti neurali complessi. Usiamo pesci transgenici in cui gonadotropina-releasing hormone (GnRH) neuroni sono geneticamente etichettati con una proteina fluorescente per l'identificazione nella preparazione cervello intatto.

Abstract

Comprendere la fisiologia delle cellule di circuiti neurali che regolano i comportamenti complessi è notevolmente migliorata utilizzando sistemi modello in cui questo lavoro può essere eseguito in una preparazione intatto cervello in cui i circuiti neurali del sistema nervoso centrale rimane intatto. Usiamo pesci transgenici in cui gonadotropina-releasing hormone (GnRH) neuroni sono geneticamente etichettati con proteina fluorescente verde per l'identificazione nel cervello intatto. I pesci hanno molteplici popolazioni di neuroni GnRH, e le loro funzioni sono dipendenti dalla loro posizione nel cervello e il gene GnRH che essi esprimono 1. Abbiamo focalizzato la nostra dimostrazione GnRH3 neuroni situati nei nervi terminali (TN) associati ai bulbi olfattivi con il cervello intatto del transgenico Medaka pesce (Figura 1B e C). Studi suggeriscono che Medaka TN-GnRH3 neuroni sono neuromodulatori, che agisce come un trasmettitore di informazioni dall'ambiente esterno al sistema nervoso centrale; tehi non svolgono un ruolo diretto nel regolare le funzioni di ipofisi-gonadi, così come il ben noto ipotalamico GnRH1 neuroni 2, 3. L'andamento tonico di azione spontanea potenziale di scarica dei neuroni TN-GnRH3 è una proprietà intrinseca 4-6, la frequenza delle quali è modulata da segnali visivi da conspecifici 2 e il neuropeptide kisspeptin 1 5. In questo video, si usa una linea stabile di Medaka transgenici in cui i neuroni TN-GnRH3 esprimono un transgene contenente la regione del promotore del Gnrh3 legato alla maggiore proteina fluorescente verde 7 per mostrare come identificare i neuroni e monitorare la loro attività elettrica in tutto il cervello preparazione 6.

Protocol

1. Dissezione di Brains da adulti Medaka Anestetizzare adulto di sesso maschile o femminile (Figura 1A) immergendo in 5 ml di MS-222 (150 mg / L, pH 7,4), attendere un paio di minuti dopo i movimenti branchie hanno cessato prima di decapitare. Tutte le procedure sono state approvate dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa della University of California-Los Angeles. Decapitare il pesce in soluzione salina di pesce alla fine caudale della opercolo con le forbici in u…

Representative Results

Un esempio di cluster bilaterali di GFP-etichettati TN-GnRH3 neuroni dal cervello asportato di Medaka pesci sono mostrati nelle figure 1B e 1C. Ogni cluster contiene circa 8-10 neuroni GnRH. Le attività neuronali spontanee del target TN-GnRH3 sono stati registrati in modalità di corrente-clamp (I = 0) con tassi di cottura tipiche di 0,5-6 Hz. Il modello di potenziale d'azione di cottura è in genere un modello di tonico o battere, con un intervallo di interspike abbastanza regolar…

Discussion

GnRH 3: GFP transgenici pesci forniscono modelli unici per studiare i meccanismi neurofisiologici alla base di integrazione neuronale e la regolamentazione nel controllo centrale di comportamenti che sono direttamente e indirettamente coinvolti nella riproduzione 3, 8-10. Uno dei vantaggi significativi di questo modello di sistema è che molti GnRH3 neuroni esprimono GFP sono vicini alla superficie ventrale del cervello, consentendo relativamente facile accesso ai neuroni di registrazione elettrofisi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo il Dott. Meng-Chin Lin e signora Yuan Dong per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del National Institutes of Health HD053767 (subappalto a NLW), e da fondi del Dipartimento di Fisiologia e Ufficio del Vice Rettore per la Ricerca, l'Università di California-Los Angeles (NLW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microscope Olympus BX50W (Upright)
Amplifier Axon Instruments Axoclamp 200B
A-D converter Computer Interference Corp. Digidata ITC-18
Cooled CCD camera PCO Computer Optics Sensicam
Xenon lamp Sutter Instruments Co.
GFP filter set Chroma Technologies
Imaging Software Intelligent Imaging Innovations Slidebook software
Electrophysiology Data Acquisition Software Axon Instruments Axograph software
Electrophysiology Data Acquisition Software AD Instruments Inc. PowerLab
Headstage for electrophysiology Axon Instruments CV 203BU
Micromanipulator Sutter Instrument Co MP-285
Recording Chamber Platform Warner Instrument Corp. P1
Recording Chamber Warner Instrument Corp. RC-26G
Electrode Puller Sutter instruments P87
Filament for electrode puller Sutter Instruments FB330B 3.0 mm wide trough filament
1.5 mm glass capillaries World Precision Instruments 1B150-4 Microelectrode for recording
Syringe Becton Dickinson 309586 3 ml
MS-222 Sigma E10521-10G Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt
Fish saline mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES
Electrode solution (loose-patch) mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose
Electrode solution (whole-cell patch) mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine

References

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Cite This Article
Zhao, Y., Wayne, N. L. Recording Electrical Activity from Identified Neurons in the Intact Brain of Transgenic Fish. J. Vis. Exp. (74), e50312, doi:10.3791/50312 (2013).

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