In questo video, dimostreremo come registrare l'attività elettrica di singoli neuroni identificati in una preparazione cervello intero, che preserva i circuiti neurali complessi. Usiamo pesci transgenici in cui gonadotropina-releasing hormone (GnRH) neuroni sono geneticamente etichettati con una proteina fluorescente per l'identificazione nella preparazione cervello intatto.
Comprendere la fisiologia delle cellule di circuiti neurali che regolano i comportamenti complessi è notevolmente migliorata utilizzando sistemi modello in cui questo lavoro può essere eseguito in una preparazione intatto cervello in cui i circuiti neurali del sistema nervoso centrale rimane intatto. Usiamo pesci transgenici in cui gonadotropina-releasing hormone (GnRH) neuroni sono geneticamente etichettati con proteina fluorescente verde per l'identificazione nel cervello intatto. I pesci hanno molteplici popolazioni di neuroni GnRH, e le loro funzioni sono dipendenti dalla loro posizione nel cervello e il gene GnRH che essi esprimono 1. Abbiamo focalizzato la nostra dimostrazione GnRH3 neuroni situati nei nervi terminali (TN) associati ai bulbi olfattivi con il cervello intatto del transgenico Medaka pesce (Figura 1B e C). Studi suggeriscono che Medaka TN-GnRH3 neuroni sono neuromodulatori, che agisce come un trasmettitore di informazioni dall'ambiente esterno al sistema nervoso centrale; tehi non svolgono un ruolo diretto nel regolare le funzioni di ipofisi-gonadi, così come il ben noto ipotalamico GnRH1 neuroni 2, 3. L'andamento tonico di azione spontanea potenziale di scarica dei neuroni TN-GnRH3 è una proprietà intrinseca 4-6, la frequenza delle quali è modulata da segnali visivi da conspecifici 2 e il neuropeptide kisspeptin 1 5. In questo video, si usa una linea stabile di Medaka transgenici in cui i neuroni TN-GnRH3 esprimono un transgene contenente la regione del promotore del Gnrh3 legato alla maggiore proteina fluorescente verde 7 per mostrare come identificare i neuroni e monitorare la loro attività elettrica in tutto il cervello preparazione 6.
GnRH 3: GFP transgenici pesci forniscono modelli unici per studiare i meccanismi neurofisiologici alla base di integrazione neuronale e la regolamentazione nel controllo centrale di comportamenti che sono direttamente e indirettamente coinvolti nella riproduzione 3, 8-10. Uno dei vantaggi significativi di questo modello di sistema è che molti GnRH3 neuroni esprimono GFP sono vicini alla superficie ventrale del cervello, consentendo relativamente facile accesso ai neuroni di registrazione elettrofisi…
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo il Dott. Meng-Chin Lin e signora Yuan Dong per l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione da parte del National Institutes of Health HD053767 (subappalto a NLW), e da fondi del Dipartimento di Fisiologia e Ufficio del Vice Rettore per la Ricerca, l'Università di California-Los Angeles (NLW).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscope | Olympus | BX50W (Upright) | |
Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 200B | |
A-D converter | Computer Interference Corp. | Digidata ITC-18 | |
Cooled CCD camera | PCO Computer Optics | Sensicam | |
Xenon lamp | Sutter Instruments Co. | ||
GFP filter set | Chroma Technologies | ||
Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | Slidebook software | |
Electrophysiology Data Acquisition Software | Axon Instruments | Axograph software | |
Electrophysiology Data Acquisition Software | AD Instruments Inc. | PowerLab | |
Headstage for electrophysiology | Axon Instruments | CV 203BU | |
Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-285 | |
Recording Chamber Platform | Warner Instrument Corp. | P1 | |
Recording Chamber | Warner Instrument Corp. | RC-26G | |
Electrode Puller | Sutter instruments | P87 | |
Filament for electrode puller | Sutter Instruments | FB330B | 3.0 mm wide trough filament |
1.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | Microelectrode for recording |
Syringe | Becton Dickinson | 309586 | 3 ml |
MS-222 | Sigma | E10521-10G | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
Fish saline | mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES | ||
Electrode solution (loose-patch) | mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose | ||
Electrode solution (whole-cell patch) | mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine |