تسجيل النشاط الكهربائي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها في الدماغ سليمة من الأسماك المعدلة وراثيا
Summary
في هذا الفيديو، ونحن سوف تظهر كيفية تسجيل النشاط الكهربائي من الخلايا العصبية التي تم تحديدها واحد في إعداد الدماغ كله، الذي يحافظ على الدارات العصبية المعقدة. نحن نستخدم الأسماك المعدلة وراثيا التي يتم تمييزها موجهة الغدد التناسلية لإفراز هرمون (هرمون GnRH) الخلايا العصبية وراثيا مع بروتين فلوري لتحديد الهوية في إعداد الدماغ سليمة.
Abstract
فهم الفيزيولوجيا الخلية من الدوائر العصبية التي تنظم السلوك المعقد هو تتعزز بشكل كبير عن طريق استخدام نظم نموذج التي يمكن من خلالها تنفيذ هذا العمل في إعداد الدماغ سليمة حيث لا يزال الدوائر العصبية في الجهاز العصبي المركزي سليمة. نحن نستخدم الأسماك المعدلة وراثيا التي يتم تمييزها موجهة الغدد التناسلية لإفراز هرمون (هرمون GnRH) الخلايا العصبية وراثيا مع بروتين الفلورية الخضراء لتحديد الهوية في الدماغ سليمة. وتحتوي الأسماك السكان متعددة من الخلايا العصبية هرمون GnRH، ووظائفها تعتمد على موقعها في المخ والجينات هرمون GnRH التي يبدونها 1. فقد ركزنا على مظاهرة لدينا GnRH3 الخلايا العصبية الموجودة في الأعصاب الطرفية (TN) المرتبطة بصيلات الشم باستخدام الدماغ سليمة من الأسماك المعدلة وراثيا الميداكا (الشكل 1B و C). تشير الدراسات إلى أن الخلايا العصبية الميداكا TN-GnRH3 هي neuromodulatory، بوصفها جهاز إرسال المعلومات من البيئة الخارجية إلى الجهاز العصبي المركزي؛ رمهلا لا تلعب دورا مباشرا في تنظيم وظائف الغدد التناسلية النخامية، كما يفعل المعروفة طائي GnRH1 الخلايا العصبية 2، 3. نمط منشط من إمكانات العمل العفوي إطلاق الخلايا العصبية TN-GnRH3 هو خاصية ذاتية 4-6، وتواتر الذي هو عن طريق التضمين الإشارات البصرية من conspecifics 2 وkisspeptin نيوروبيبتيدي 1 5. في هذا الفيديو، ونحن نستخدم خط مستقر من الميداكا المعدلة وراثيا في الخلايا العصبية التي TN-GnRH3 تعبر عن التحوير الذي يحتوي على منطقة المروج من Gnrh3 مرتبطة تعزيز البروتين الفلوري الأخضر 7 لتظهر لك كيفية التعرف على الخلايا العصبية ورصد نشاطهم الكهربائية في الدماغ كله إعداد 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
هرمون GnRH 3: GFP الأسماك المعدلة وراثيا تقدم نماذج فريدة لدراسة الآليات العصبية الكامنة وراء التكامل العصبية والتنظيم في السيطرة المركزية من السلوكيات التي هي على حد سواء يشارك بصورة مباشرة وغير مباشرة في الإنجاب 3، 8-10. واحدة من مزايا كبيرة من هذا النظام النم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور منغ تشين لين والسيدة دونغ يوان للمساعدة التقنية. وأيد هذا العمل من خلال منحة من المعاهد القومية للصحة HD053767 (من الباطن إلى NLW)، وصناديق من قسم علم وظائف الأعضاء ومكتب نائب مدير الجامعة للأبحاث، جامعة كاليفورنيا في لوس انجليس (NLW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Olympus | BX50W (Upright) | |
| Amplifier | Axon Instruments | Axoclamp 200B | |
| A-D converter | Computer Interference Corp. | Digidata ITC-18 | |
| Cooled CCD camera | PCO Computer Optics | Sensicam | |
| Xenon lamp | Sutter Instruments Co. | ||
| GFP filter set | Chroma Technologies | ||
| Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | Slidebook software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | Axon Instruments | Axograph software | |
| Electrophysiology Data Acquisition Software | AD Instruments Inc. | PowerLab | |
| Headstage for electrophysiology | Axon Instruments | CV 203BU | |
| Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-285 | |
| Recording Chamber Platform | Warner Instrument Corp. | P1 | |
| Recording Chamber | Warner Instrument Corp. | RC-26G | |
| Electrode Puller | Sutter instruments | P87 | |
| Filament for electrode puller | Sutter Instruments | FB330B | 3.0 mm wide trough filament |
| 1.5 mm glass capillaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | Microelectrode for recording |
| Syringe | Becton Dickinson | 309586 | 3 ml |
| MS-222 | Sigma | E10521-10G | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
| Fish saline | mM: 134 NaCl; 2.9 KCl; 2.1 CaCl2; 1.2 MgCl2; 10 HEPES | ||
| Electrode solution (loose-patch) | mM: 150 NaCl; 3.5 KCl; 2.5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; 10 glucose | ||
| Electrode solution (whole-cell patch) | mM: 112.5 K-gluconate; NaCl; 17.5 KCl; 0.5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0.1 leupeptin;10 phospho-creatine |
References
- Kah, O., Lethimonier, C., Lareyre, J. J. Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) in the animal kingdom. J. Soc. Biol. 198 (1), 53-60 (2004).
- Ramakrishnan, S., Wayne, N. L. Social cues from conspecifics alter electrical activity of gonadotropin-releasing hormone neurons in the terminal nerve via visual signals. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 297 (1), R135-R141 (2009).
- Abe, H., Oka, Y. Mechanisms of neuromodulation by a nonhypophysiotropic GnRH system controlling motivation of reproductive behavior in the teleost. 57 (6), 665-674 (2011).
- Oka, Y. Tetrodotoxin-resistant persistent Na+ current underlying pacemaker potentials of fish gonadotrophin-releasing hormone neurones. J. Physiol. 482 (Pt. 1), 1-6 (1995).
- Zhao, Y., Wayne, N. L. Effects of Kisspeptin1 on Electrical Activity of an Extrahypothalamic Population of Gonadotropin-Releasing Hormone Neurons in Medaka. PLoS One. 7 (5), e37909 (2012).
- Wayne, N. L., et al. Whole-cell electrophysiology of gonadotropin-releasing hormone neurons that express green fluorescent protein in the terminal nerve of transgenic medaka (Oryzias latipes). Biol. Reprod. 73 (6), 1228-1234 (2005).
- Okubo, K., et al. Forebrain gonadotropin-releasing hormone neuronal development: insights from transgenic medaka and the relevance to X-linked Kallmann syndrome. Endocrinology. 147 (3), 1076-1084 (2006).
- Okubo, K., et al. A novel form of gonadotropin-releasing hormone in the medaka, Oryzias latipes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 276 (1), 298-303 (2000).
- Ramakrishnan, S., et al. Acquisition of spontaneous electrical activity during embryonic development of gonadotropin-releasing hormone-3 neurons located in the terminal nerve of transgenic zebrafish (Danio rerio). Gen. Comp. Endocrinol. 168 (3), 401-407 (2010).
- Abraham, E., et al. Targeted gonadotropin-releasing hormone-3 neuron ablation in zebrafish: effects on neurogenesis, neuronal migration, and reproduction. Endocrinology. 151 (1), 332-340 (2010).
- Wayne, N. L., Kuwahara, K. Beta-endorphin alters electrical activity of gonadotropin releasing hormone neurons located in the terminal nerve of the teleost medaka (Oryzias latipes. Gen. Comp. Endocrinol. 150 (1), 41-47 (2007).
- Oka, Y. Three types of gonadotrophin-releasing hormone neurones and steroid-sensitive sexually dimorphic kisspeptin neurones in teleosts. J. Neuroendocrinol. 21 (4), 334-338 (2009).
- Molleman, A. . Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , (2003).
