Análises população de células da pele Durante Carcinogênese
Summary
Carcinogênese é um processo que envolve as interações entre células cancerosas e microambiente do câncer. Para dissecar os eventos moleculares, é necessário para isolar populações de células diferentes em diferentes estágios durante o desenvolvimento do cancro. Usando um modelo de rato para o carcinoma basocelular, nós descrevemos um protocolo para análises celulares durante a carcinogênese.
Abstract
O cancro é o desenvolvimento de um processo de múltiplas etapas, envolvendo vários tipos de células, incluindo células cancerosas precursoras, células imunes, fibroblastos e células endoteliais. Cada tipo de células sofre de sinalização e alterações funcionais durante a carcinogénese. O desafio atual para muitos pesquisadores de câncer é dissecar essas mudanças em cada tipo de célula durante o processo de várias etapas in vivo. Nos últimos anos, os autores desenvolveram um conjunto de procedimentos para isolar populações diferentes de células durante o desenvolvimento do câncer de pele usando K14creER/R26-SmoM2 camundongos YFP. O procedimento é dividido em seis partes: 1) gerar ratos adequados para o estudo (K14creER + e R26-SmoM2 YFP + camundongos neste protocolo), 2) indução SmoM2 expressão YFP na pele do rato, 3) preparando biópsias da pele do rato; 4) isolar epiderme da pele; 5) preparar uma única célula de epiderme; 6) rotulagem populações de células individuais para análise de citometria de fluxo.Geração de número suficiente de ratos com o genótipo direito é o passo limitante neste protocolo, o que pode levar até dois meses. O restante das etapas demorar algumas horas até alguns dias. Dentro deste protocolo, que também incluem uma seção para solucionar problemas. Apesar de se concentrar sobre o câncer de pele, este protocolo pode ser modificado para se candidatar a outros modelos animais de doenças humanas.
Introduction
Como o tipo mais comum de câncer humano, carcinoma basocelular (CBC) afeta cerca de 2 milhões de americanos por ano 1. Evidências indicam que a ativação anormal de hedgehog (hh) de sinalização é a força motriz subjacente desenvolvimento BCC (Avaliado em 2,3). Alterações de sinalização Hh em CBCs incluem mutações inativadoras de PTCH1 4-6, mutações de função ganho de SMO 7-9 e expressão aberrante de Hh via fatores de transcrição Gli1 10 e Gli2 11 ou raras mutações inativados do Su regulador negativo (Fu ) 12. Através de todos estes e outros estudos, a Federal Drug Administration (FDA) aprovou recentemente o uso de inibidor de sinalização Hh Vismodegib para tratar localmente avançado e metastático CBCs 13-15.
Apesar de todas essas conquistas de 16, nós ainda não entendemos os mecanismos celulares e moleculares pelos quais Hh sinalização dirige carcinogenesis. Estabelecer modelos animais usando a ativação de tecidos específicos de sinalização Hh ainda é importante para os estudos e para a nossa compreensão da resistência às drogas. Em ratos, camundongos selvagens não desenvolvem CBCs, mesmo sob altas doses de substâncias cancerígenas, a radiação UV ou ionizante. Em contraste, Ptch1 + / – murganhos são susceptíveis ao desenvolvimento de BCC 17,18. A penetrância de desenvolvimento BCC em Ptch1 + / – ratos é superior a 50%, embora Ptch1 18,19 + / – camundongos raramente desenvolvem CBCs adultas se mantido em condições normais. Devido à letalidade embrionária de Ptch1 – / -, ko específica de tecido de PTCH1 é geralmente utilizada para o estudo de 20. Além disso, condicional expressão específica de pele de oncogênico SmoM2 YFP (KRT14-creer: R26-SmoM2 YFP ou KRT14-cre: R26-SmoM2 YFP) leva à formação de múltiplos CBCs microscópicas em uma idade muito precoce, proporcionando uma análise genética fácil para hh sinalização fazerwnstream de SMO 21.
Há três questões importantes em nosso conhecimento da biologia BCC. Primeiro, a origem celular dos CBCs não está totalmente claro. Embora alguns estudos suportam a ceder do folículo de cabelo como o local de célula estaminal 22-24, Youssef et al. 25 localizada na célula de origem murina de tumores cutâneos Hh orientadas para a epiderme na região inter-folicular, e não no folículo piloso , utilizando Cre específica de células para activar a expressão de um Rosa26 orientada transgénico mutante SMO. Em segundo lugar, as interacções celulares durante o desenvolvimento BCC não são bem compreendidos. Sabe-se que os queratinócitos activada com Hh sinalização podem levar à formação de BCC, mas outras alterações celulares não são bem compreendidos. Além disso, o tratamento de antagonistas de Smo em ratinhos pode conduzir a resistência aos fármacos 26-28. São bastante necessárias, assim, novos alvos para BCC. Entender essas três questões requer análises de alterações celulares em camundongos durante carcinogenesis. Embora vários métodos têm sido publicados para a cultura de queratinócitos, citometria de fluxo e isolamento de células-tronco da pele 29-31, atualmente não há procedimentos completos para análise de células em CBCs do mouse. Através da combinação de métodos para o modelo do rato de CBCs, a separação da epiderme, a geração de células isoladas do tecido e análises celulares, vamos proporcionar aos leitores um conjunto de procedimentos para estudar a sinalização celular, celular e interações moleculares durante o desenvolvimento do BCC. Nós acreditamos que este protocolo vai permitir que os leitores para ver como cada procedimento é realizado. Além disso, nós fornecemos alguns dados para ilustrar o que o resultado deve ser semelhante, e solução de problemas para ajudar os leitores a superar as dificuldades durante a realização desses procedimentos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrevemos um método para a análise da população de células em CBCs. Tecidos tumorais são consistentes de muitos tipos de células, e cada tipo de célula comporta-se de forma diferente a um determinado momento da carcinogénese, o qual é muito difícil de recuperar, mesmo sob as melhores condições in vitro. Usando este protocolo, que mostrou que o desenvolvimento do carcinoma basocelular é acompanhado pela expansão das células-tronco epidérmicas, bem como o recrutamento de células mielóides. Em comparação com a imuno-histoquímica ou análises de imunofluorescência, análise da população de células apresentam uma avaliação quantitativa das alterações mais populações de células uma vez que os anticorpos específicos para uma variedade de tipos de células estão agora disponíveis.
Para este protocolo, são necessárias 10 semanas para completar o estudo porque a mudança fenotípica da indução de genes requer tempo. Assim, é importante para planejar o experimento antes do tempo. Para o isolamento e análise de células, podem ser necessários dois dias inteiros. Como as células vivas são usadas para analyses, é importante para reservar um FACSCalibur antes do tempo. Temos também listado problemas comuns quando se trabalha com este protocolo (ver abaixo).
Em nossa experiência, a seguir são problemas comuns que encontramos:
- Separação da epiderme Pobre: Isto pode ser causado por tratamento com dispase incompleta (por favor, aumentar o tempo de tratamento diapase) ou solução de dispase insuficiente (A pele necessita de ser totalmente imerso na solução de dispase). O uso de pelo menos 5 ml de solução de dispase para um rato. O volume pode variar com base no tamanho da pele.
- Baixo rendimento do número de células: Isto pode, devido à digestão incompleta com colagenase IV. Por favor, primeira concentração de colagenase cheque ou data de validade. Isto também pode ser causada por uma quantidade insuficiente de epiderme utilizado. Além disso, a digestão enzimática deve ser realizada a até 37 ° C com agitação (por favor, ajustar a temperatura antes de realizar a digestão).
- Aglomerados de células: Isso é muito comum para as células da pele (células de pipetaalgumas vezes, depois de passar pelo filtro (antes da centrifugação), ou a existência de Mg 2 + e Ca 2 + em solução (utilize o Mg 2 + e Ca 2 + livre de PBS por lavagem celular).
- Muitas células mortas: Este pode ser um resultado de tecidos degradados (por favor, use tecidos frescos), ou over-digestão (evitar incubação prolongada com dispase e colagenase IV).
Este protocolo pode ser combinado com o transplante de medula óssea ou transplante de tecidos para examinar a célula de origem. Por exemplo, o transplante de células que expressam a GFP de medula óssea em ratinhos letalmente irradiados irá permitir-nos a examinar a contribuição das células da medula óssea para os fibroblastos associados a tumores e células mielóides. Da mesma forma, os tumores da pele podem ser transplantadas para um novo hospedeiro rato para examinar interacções tumor-hospedeiro.
Além de examinar as mudanças população de células durante a carcinogênese, este protocolo também permitirá aos investigadores examinarEfeitos do tratamento com drogas para as células no ambiente tumoral. Embora este protocolo foi projetado para usar para análises população de células da pele durante a carcinogênese e pequenas modificações podem ser feitas para outros tipos de câncer.
Em resumo, as análises da população de células em modelos de ratos de câncer de pele pode dar-nos as mudanças dinâmicas celulares durante a carcinogênese, levando a uma melhor compreensão da biologia celular na transformação neoplásica e diferentes eventos celulares no processo de transformação.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo NCI (R01-R01-94160 e 155086), IU Simon Cancer Center e Wells Centro de Investigação Pediátrica.
Materials
| Reagents | Company | Cat# | Comments |
| directPCR lysis reagent (tail) | Viagen Biotech | 102-T | store @ 4 °C |
| proteinase K | Sigma | P2308 | store @ -20 °C |
| ApliTag 360 taq polymerase | Applied biosystems | N8080155 | store @ -20 °C |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | store @ 4 °C |
| Feeding needle (20 gauge) | Fisher scientific | 01-290-9B | |
| Dispase | Roche Diagnostic | 04942078001 | store @ 4 °C |
| Collagenase IV | Worthington | LS004189 | store @ -20 °C |
| Cell strainer | Fisher scientific | 08-771-2 | |
| Anti-CD11b-PE | eBioscience | 12-0112-81 | store @ 4 °C |
| Anti-Gr1-APC | eBioscience | 17-5931-81 | store @ 4 °C |
| Anti-vimentin-FITC | eBioscience | 11-9897-80 | store @ 4 °C |
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