細胞集団分析スキン発がん中

この研究は、医学インディアナ大学でIACUC委員会によって承認されています。 1。正しい遺伝子型を持つマウスを作製のBCCのマウスモデルを確立します。メイトK14-クレエマウスR26-SmoM2 YFPマウス （ジャクソン研究所ストック番号005130）（18）と（ジャクソン実験室ストック番号005107）K14-クレエ+とR26-SmoM2 YFP +マウスを生成する。 ジェノタイピングを行います。 1 mg / mlのプロテ​​イナーゼKとdirectPCRテール溶解液に浸し尾検体（0.5センチ）55℃で振とうしながら一晩。翌日、マイクロ遠心機（ジェノタイピングのために上清を維持するため）で最高速度で遠心分離することにより、組織の破片を除去。ベンダが推奨するプライマー及び条件で各PCR反応のために上清の1μlを使用する。 FO右遺伝子を有するマウスを選択してください（3-6週齢で、0.05〜0.1 mg / kg体重でブプレノルフィンは2〜3日ごとに8-12時間尾中略後SQを介して適用されます）rは、手順2。 2。皮膚のケラチノサイトにおけるSmoM2の発現を誘導する給餌針（20ゲージを湾曲）と強制経口投与を経由して5日間連続してタモキシフェン（各給餌における植物油50ml中5μgの/ kg体重）の経口投与によるケラチノサイトにおけるSmoM2発現を誘導する。 3。皮膚標本の準備一般的には、表現型はK14creER/R26SmoM2 GFPマウスの耳としっぽでより深刻である。細胞分析の準備をするために、我々は最初の機関承認手続（CO 2プラス頸椎脱臼）と動物の犠牲の後にマウスの皮膚を収穫。 4。表皮を分離承認手続き（ステップ3を参照）犠牲マウスの後、トリマーを使用してファーを取り外します。 37℃でディスパーゼ溶液（10％FBSを含むDMEMで5 mg / ml）で1〜2時間（未満8週齢と2時間マウスで1時間Cに浸し皮膚標本）8週より齢のマウスのために。 以下のディスパーゼ処理、鉗子によって真皮から分離表皮。 5。単一細胞を作製 37℃で1〜2時間、コラゲナーゼIV溶液（10％FBSを含むDMEM中で1 mg / mlの）に浸した後、単一の細胞集団を得るはさみによって表皮をミンチとする°〜50 mlチューブでC。優しく渦管の細胞解離を助けるために20分ごとにしてみてください。 顕微鏡下で細胞解離を点検。単一細胞はコラゲナーゼ媒体に検出することができる場合には、細胞収率を高めるためにさらに30分間試料をインキュベートする。一般的には、マウスを一から表皮は、10 7個まで得ることができる。 ベンチトップ遠心分離によって1,500 rpmで、セルストレーナー（細孔径70μm）を経由して、組織の混合、スピン細胞をダウンフィルタリングし、PBSで1回時間を洗う。 6。ラベルの細胞およびフローサイトメトリー解析を実行 10％FBSで細胞を再懸濁しPBSで非特異的結合をブロックするために2.5×10 6細胞/ ml（30分間氷上で）少なくとも特定の抗体標識用の1.5ミリリットルマイクロチューブのそれぞれに細胞のアリコートを取る。 2μgの/ mlの最終濃度で各チューブに異なる抗体を加える。数秒間穏やか頂点を経由して細胞と抗体を混合し、1mlのPBSで洗浄後、30分間氷上にそれらを残す。 （詳細については、試薬を参照）ビメンチン-FITC（線維芽細胞）のCD11b-PEプラスGr1と-APC（骨髄細胞や骨髄由来のサプレッサー細胞）：BCC標本のために、我々は次のバイオマーカーのための抗体を使用していました。 細胞内染色のために、我々はキットを使用します（詳細については試薬を参照）ベンダーの説明書に従ってください。我々は、細胞表面マーカーを分析するために新たなセルを使用。表面マーカー染色後、細胞を洗浄し、PBSに再懸濁し。 1μgの/ mlの最終濃度で細胞混合物にDAPIを追加する。 DAPIはさらに分析からゲーテッド外となり死んだ細胞を染色します。 納入仕様を使用してデータを分析するCソフトウェア。我々は最初のFSC対SSCプロットに基づいて単一のセルを選択して、さらに分析するためにDAPI陰性人口（生細胞）を使用します。