تحليلات السكان الخلية خلال الجلد التسرطن
Summary
التسرطن هو عملية تنطوي على التفاعل بين الخلايا السرطانية والمكروية السرطان. لتشريح الأحداث الجزيئية، ويحتاج المرء لعزل السكان خلية مختلفة في مراحل مختلفة خلال تطور مرض السرطان. باستخدام نموذج الفأر لسرطان الخلايا القاعدية، ونحن تصف بروتوكول للتحليلات الخلية خلال التسرطن.
Abstract
تطور مرض السرطان هو عملية متعددة الخطوات التي تنطوي على العديد من أنواع الخلايا بما في ذلك خلايا سرطان السلائف، الخلايا المناعية، الخلايا الليفية والخلايا البطانية. كل نوع من الخلايا يخضع لإشارات وظيفية التغيرات خلال التسرطن. التحدي الحالي لكثير من الباحثين السرطان هو لتشريح هذه التغييرات في كل نوع من الخلايا أثناء عملية متعددة الخطوات في الجسم الحي. في السنوات القليلة الماضية، وضعت الكتاب مجموعة من الإجراءات لعزل السكان خلية مختلفة أثناء تطوير سرطان الجلد باستخدام K14creER/R26-SmoM2 YFP الفئران. وينقسم هذا الإجراء إلى 6 أجزاء: 1) توليد الفئران المناسبة للدراسة (K14creER + وR26-SmoM2 YFP + الفئران في هذا البروتوكول)، 2) حمل SmoM2 YFP التعبير في الجلد الماوس؛ 3) إعداد خزعات الجلد الماوس، 4) عزل البشرة من الجلد؛ 5) إعداد الخلايا واحد من البشرة؛ 6) وصفها السكان خلية واحدة لتحليل التدفق الخلوي.توليد عدد كاف من الفئران مع التركيب الوراثي الصحيح هو الخطوة تحد في هذا البروتوكول، والذي قد يستغرق فترة تصل الى شهرين. بقية الخطوات يستغرق بضع ساعات إلى بضعة أيام. في هذا البروتوكول، ونحن تتضمن أيضا قسم لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها. على الرغم من أننا نركز على سرطان الجلد، ويجوز تعديل هذا البروتوكول إلى تقديم طلب للحصول النماذج الحيوانية الأخرى من الأمراض التي تصيب الإنسان.
Introduction
كما النوع الاكثر شيوعا من سرطان الإنسان، وسرطان الخلايا القاعدية (BCC) يؤثر على حوالي 2 مليون أميركي سنويا 1. تراكم الأدلة تشير إلى أن تفعيل الشاذ من القنفذ (HH) إشارات هي القوة الدافعة وراء تطوير BCC (مراجعة في 2،3). التعديلات سمو يشير في بطاقات عبور الحدود وتشمل الطفرات تعطيل من PTCH1 4-6، والطفرات مكاسب من وظيفة من SMO 7-9، والتعبير المنحرف سمو عوامل النسخ مسار GLI1 10 و 11 GLI2 أو الطفرات المعطل نادرة من السلبية سو منظم (فو ) 12. من خلال كل هذه الدراسات وغيرها، وقد وافق الدواء الاتحادية (FDA) في الآونة الأخيرة استخدام سمو إشارات المانع Vismodegib لعلاج النقيلي المتقدمة محليا وبطاقات عبور الحدود 13-15.
على الرغم من كل هذه الإنجازات 16، ونحن ما زلنا لا نفهم الآليات الجزيئية والخلوية التي اتش اتش إشارات يدفع CARCتكون النسيج الليفي. إنشاء نماذج حيوانية باستخدام تنشيط الأنسجة محددة سمو إشارات لا يزال من المهم لهذه الدراسات وعلى فهمنا لمقاومة العقاقير. في الفئران، والفئران البرية من نوع لا تتطور بطاقات عبور الحدود، حتى في ظل جرعات كبيرة من المواد المسببة للسرطان، الأشعة فوق البنفسجية أو المؤينة. في المقابل، Ptch1 + / – الفئران عرضة لتطوير BCC 17،18. وانتفاذ التنمية BCC في Ptch1 + / – الفئران هي أكثر من 50٪ 18،19 على الرغم من Ptch1 + / – الفئران نادرا تطوير بطاقات عبور الحدود مكتملة النمو إذا كان يحتفظ بها في ظل ظروف طبيعية. ويرجع ذلك إلى الفتك الجنينية من Ptch1 – / -، ويستخدم خروج المغلوب الأنسجة محددة من PTCH1 عموما لدراسة 20. وبالإضافة إلى ذلك، مشروط التعبير الجلد محددة من أنكجنيك SmoM2 YFP (Krt14-creER: R26-SmoM2 YFP أو Krt14-جنة المساواة العرقية: R26-SmoM2 YFP) يؤدي إلى تشكيل بطاقات عبور الحدود مجهرية متعددة في سن مبكرة جدا، وتوفير الفحص الجيني سهلة لل إشارات سمو تفعلwnstream من SMO 21.
هناك ثلاث قضايا رئيسية في معرفتنا البيولوجيا BCC. الأول، وأصل الخلوية من بطاقات عبور الحدود ليست واضحة تماما. في حين دعم بعض الدراسات تتزحزح من بصيلات الشعر كموقع الخلايا الجذعية 22-24، يوسف وآخرون. 25 مترجمة الخلية الفئران من أصل الجلدية الأورام HH-مدفوعة لتكون في المنطقة البشرة بين مسامي، وليس في بصيلات الشعر ، وذلك باستخدام لجنة المساواة العرقية خلية محددة لتفعيل التعبير من يحركها ROSA26 المعدلة وراثيا متحولة SMO. وثانيا، التفاعلات الخلوية خلال تطوير BCC يست مفهومة جيدا. ومن المعروف أن الخلايا الكيراتينية مع المنشط اتش اتش الإشارات يمكن أن يؤدي إلى تشكيل بطاقات عبور الحدود، ولكن ليست مفهومة جيدا التغيرات الخلوية الأخرى. وعلاوة على ذلك، يمكن علاج مضادات بيانات التزامات العضوية في الفئران يؤدي إلى مقاومة المخدرات 26-28. نحن بأمس الحاجة إلى أهداف وبالتالي رواية لBCC. فهم هذه القضايا الثلاث يتطلب تحليل التغيرات الخلوية في الفئران خلال carcinogenesis. في حين تم نشر العديد من الأساليب للثقافة الكيراتينية، التدفق الخلوي والجلد الجذعية العزلة الخلية 29-31، وهناك حاليا أي إجراءات شاملة لتحليل الخلية في بطاقات عبور الحدود الماوس. من خلال الجمع بين الأساليب لنموذج الفأر من بطاقات عبور الحدود، والفصل بين البشرة، وتوليد الخلايا واحد من الأنسجة وتحليلات الخلية، وسوف نقدم للقراء مع مجموعة من الإجراءات لدراسة إشارة الخلية الخلوية والتفاعلات الجزيئية أثناء تطوير BCC. ونحن نعتقد أن هذا البروتوكول سوف تسمح للقراء لمعرفة كيف يتم إنجاز كل إجراء. وبالإضافة إلى ذلك، قدمنا بعض البيانات لتوضيح ما هي النتائج يجب أن تبدو، ومخرج لمساعدة القراء على التغلب على الصعوبات أثناء تنفيذ هذه الإجراءات.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد وصفت لنا طريقة لتحليل السكان الخلية في بطاقات عبور الحدود. أنسجة الورم متسقة من العديد من أنواع الخلايا، ولكل نوع من الخلايا تتصرف بشكل مختلف في وقت معين من التسرطن، والتي من الصعب جدا لاستعادة حتى في ظل أفضل الظروف في المختبر. باستخدام هذا البروتوكول، ونحن أظهرت أن التنمية من سرطان الخلايا القاعدية يرافقه توسع من الخلايا الجذعية البشرة وكذلك تجنيد خلايا الدم النخاعي. بالمقارنة مع المناعية أو مناعي التحليلات، تحليلات السكان الخلية إعطاء تقييم أكثر كمية من التغيرات السكانية الخلية منذ الاجسام المضادة المحددة لمجموعة متنوعة من أنواع الخلايا متاحة الآن.
لهذا البروتوكول، وهناك حاجة إلى 10 أسابيع لاستكمال الدراسة وذلك لأن التغيير المظهري من تحريض الجينات يتطلب وقتا. وبالتالي فمن المهم أن تخطط التجربة في وقت مبكر. لعزل الخلايا وتحليلات، قد تكون هناك حاجة يومين كله. لأنه يتم استخدام الخلايا الحية لanalysES، فمن المهم أن حجز FACSCalibur في وقت مبكر. لدينا قائمة أيضا المشاكل الشائعة عند العمل مع هذا البروتوكول (انظر أدناه).
في تجربتنا، وفيما يلي المشاكل الشائعة التي واجهناها:
- الفصل الفقراء من البشرة: قد يكون سبب ذلك عن طريق العلاج dispase غير مكتملة (الرجاء زيادة وقت العلاج diapase) أو حل dispase غير كافية (يحتاج الجلد لتكون مغمورة تماما في الحل dispase). نحن نستخدم ما لا يقل عن 5 مل من محلول dispase للماوس واحدة. قد تختلف حجم استنادا إلى حجم من الجلد.
- العائد المنخفض من عدد الخلايا: هذا قد يرجع إلى الهضم غير مكتملة مع كولاجيناز الرابع. أولا الرجاء تركيز كولاجيناز الاختيار أو تاريخ انتهاء الصلاحية. ويمكن أيضا أن يكون سبب ذلك عن طريق كمية كافية من البشرة المستخدمة. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن يقوم انزيم الهضم في إلى 37 درجة مئوية مع الهز (يرجى ضبط درجة الحرارة قبل إجراء عملية الهضم).
- كتل من الخلايا: هذا أمر شائع جدا لخلايا الجلد (الخلايا ماصةبضع مرات بعد الذهاب من خلال مصفاة (قبل الطرد المركزي)، أو وجود المغنيسيوم 2 + والكالسيوم 2 + في الحل (يرجى استخدام المغنيسيوم 2 + وكا 2 + خالية من برنامج تلفزيوني لغسل الخلية).
- عدد كبير جدا من الخلايا الميتة: قد يكون هذا نتيجة لأنسجة المتدهورة (يرجى استخدام الأنسجة الطازجة)، أو الإفراط في الهضم (تجنب الحضانة موسع مع dispase وكولاجيناز الرابع).
ويمكن الجمع بين هذا البروتوكول مع زرع نخاع العظام أو زرع الأنسجة لدراسة منشأ الخلية. على سبيل المثال، زرع GFP، معربا عن خلايا نخاع العظام في الفئران المعرضة للإشعاع قاتل سوف تسمح لنا للنظر في مساهمة خلايا نخاع العظام إلى الخلايا الليفية الورم المصاحب وخلايا الدم النخاعي. وبالمثل، يمكن زرعها أورام الجلد إلى مجموعة الفأرة الجديدة لدراسة التفاعلات ورم المضيف.
بالإضافة إلى دراسة التغيرات السكانية الخلية خلال التسرطن، وسوف يسمح هذا البروتوكول أيضا الباحثين لدراسةآثار العلاجات المخدرات إلى الخلايا في بيئة الورم. على الرغم من أن هذا البروتوكول يهدف إلى استخدام لتحاليل السكان الخلية خلال الجلد التسرطن، تعديلات طفيفة يمكن أن يتم لأنواع السرطان الأخرى.
وباختصار، يمكن أن التحليلات السكانية خلية في نماذج الماوس من سرطان الجلد تعطينا التغيرات الديناميكية الخلوية خلال التسرطن، مما يؤدي إلى فهم أفضل لبيولوجيا الخلية في التحول الأورام والأحداث الخلوية المختلفة في عملية التحول.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذه الدراسة من قبل لجنة التحقيق الوطنية (R01-R01-94160 و155086)، IU مركز السرطان ومركز سيمون ويلز لأبحاث طب الأطفال.
Materials
| Reagents | Company | Cat# | Comments |
| directPCR lysis reagent (tail) | Viagen Biotech | 102-T | store @ 4 °C |
| proteinase K | Sigma | P2308 | store @ -20 °C |
| ApliTag 360 taq polymerase | Applied biosystems | N8080155 | store @ -20 °C |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | store @ 4 °C |
| Feeding needle (20 gauge) | Fisher scientific | 01-290-9B | |
| Dispase | Roche Diagnostic | 04942078001 | store @ 4 °C |
| Collagenase IV | Worthington | LS004189 | store @ -20 °C |
| Cell strainer | Fisher scientific | 08-771-2 | |
| Anti-CD11b-PE | eBioscience | 12-0112-81 | store @ 4 °C |
| Anti-Gr1-APC | eBioscience | 17-5931-81 | store @ 4 °C |
| Anti-vimentin-FITC | eBioscience | 11-9897-80 | store @ 4 °C |
References
- Rogers, H. W., et al. Incidence estimate of nonmelanoma skin cancer in the United States. Arch. Dermatol. 146, 283-287 (2006).
- Epstein, E. H. Basal cell carcinomas: attack of the hedgehog. Nat. Rev. Cancer. 8, 743-754 (2008).
- Yang, L., Xie, G., Fan, Q., Xie, J. Activation of the hedgehog-signaling pathway in human cancer and the clinical implications. Oncogene. 29, 469-481 (2010).
- Johnson, R. L., et al. Human homolog of patched, a candidate gene for the basal cell nevus syndrome. Science. 272, 1668-1671 (1996).
- Hahn, H., et al. A mammalian patched homolog is expressed in target tissues of sonic hedgehog and maps to a region associated with developmental abnormalities. J. Biol. Chem. 271, 12125-12128 (1996).
- Hahn, H., et al. Mutations of the human homolog of Drosophila patched in the nevoid basal cell carcinoma syndrome. Cell. 85, 841-851 (1996).
- Xie, J., et al. Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma. Nature. 391, 90-92 (1998).
- Reifenberger, J., et al. Missense mutations in SMOH in sporadic basal cell carcinomas of the skin and primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system. Cancer Res. 58, 1798-1803 (1998).
- Lam, C. W., et al. A frequent activated smoothened mutation in sporadic basal cell carcinomas. Oncogene. 18, 833-836 (1999).
- Nilsson, M., et al. Induction of basal cell carcinomas and trichoepitheliomas in mice overexpressing GLI-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3438-3443 (2000).
- Sheng, H., et al. Dissecting the oncogenic potential of Gli2: deletion of an NH(2)-terminal fragment alters skin tumor phenotype. Cancer Res. 62 (2), 5308-5316 (2002).
- Reifenberger, J., et al. Somatic mutations in the PTCH, SMOH, SUFUH and TP53 genes in sporadic basal cell carcinomas. Br. J. Dermatol. 152, 43-51 (2005).
- Guha, M. Hedgehog inhibitor gets landmark skin cancer approval, but questions remain for wider potential. Nat. Rev. Drug Discov. 11, 257-258 (2012).
- Sekulic, A., et al. Efficacy and safety of vismodegib in advanced basal-cell carcinoma. N. Engl. J. Med. 366, 2171-2179 (2012).
- Tang, J. Y., et al. Inhibiting the hedgehog pathway in patients with the basal-cell nevus syndrome. N. Engl. J. Med. 366, 2180-2188 (2012).
- Aszterbaum, M., et al. Ultraviolet and ionizing radiation enhance the growth of BCCs and trichoblastomas in patched heterozygous knockout mice. Nat. Med. 5, 1285-1291 (1999).
- Pazzaglia, S., et al. Modulation of patched-associated susceptibility to radiation induced tumorigenesis by genetic background. Cancer Res. 64, 3798-3806 (2004).
- Athar, M., et al. Inhibition of smoothened signaling prevents ultraviolet B-induced basal cell carcinomas through regulation of Fas expression and apoptosis. Cancer Res. 64, 7545-7552 (2004).
- Mancuso, M., et al. Basal cell carcinoma and its development: insights from radiation-induced tumors in Ptch1-deficient mice. Cancer Res. 64, 934-941 (2004).
- Ellis, T., et al. Patched 1 conditional null allele in mice. Genesis. 36, 158-161 (2003).
- Mao, J., et al. A novel somatic mouse model to survey tumorigenic potential applied to the Hedgehog pathway. Cancer Res. 66, 10171-10178 (2006).
- Wang, G. Y., Wang, J., Mancianti, M. L., Epstein, E. H. Basal cell carcinomas arise from hair follicle stem cells in Ptch1(+/-) mice. Cancer Cell. 19, 114-124 (2011).
- Grachtchouk, M., et al. Basal cell carcinomas in mice arise from hair follicle stem cells and multiple epithelial progenitor populations. J. Clin. Invest. 121, 1768-1781 (2011).
- Kasper, M., et al. Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4099-4104 (2011).
- Youssef, K. K., et al. Identification of the cell lineage at the origin of basal cell carcinoma. Nat Cell Biol. 12, 299-305 (2010).
- Yauch, R. L., et al. Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma. Science. 326, 572-574 (2009).
- Buonamici, S., et al. Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma. Sci. Transl. Med. 2, 51ra70 (2010).
- Dijkgraaf, G. J., et al. Small molecule inhibition of GDC-0449 refractory smoothened mutants and downstream mechanisms of drug resistance. Cancer Res. 71, 435-444 (2011).
- Guo, Z., Draheim, K., Lyle, S. Isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin. J. Vis. Exp. (49), e2561 (2011).
- Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Herlyn, M. The three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal skin and melanoma progression. J. Vis. Exp. (54), e2937 (2011).
- Anacker, D., Moody, C. Generation of organotypic raft cultures from primary human keratinocytes. J. Vis. Exp. (60), e3668 (2012).
