بحكم الرحم الصعق الكهربائي وإإكسبلنتس نصف الكرة المجموع: طريقة بسيطة للدراسات التجريبية التنمية القشرية في وقت مبكر
Summary
يصف هذا البروتوكول إجراء يزدرع المحسنة التي ينطوي<em> السابقين الرحم</em> الصعق الكهربائي، وتشريح ثقافة نصفي الكرة المخية بالكامل من الماوس الجنينية. إعداد الدراسات الدوائية ويسهل المقايسات وظيفة الجين خلال التنمية القشرية في وقت مبكر.
Abstract
القشرية التنمية ينطوي على التفاعلات المعقدة بين الخلايا العصبية وغير العصبية العناصر بما في ذلك الخلايا السلائف، والأوعية الدموية، والسحايا المصفوفة خارج الخلية المرتبطة بها. لأنها توفر بيئة مناسبة عضوي النمط، وغالبا ما تستخدم إإكسبلنتس شريحة القشرية للتحقيق في تلك التفاعلات العصبية التي تتحكم التمايز والتنمية. على الرغم من فائدة، لا يمكن للنموذج يزدرع شريحة تعاني من عيوب بما في ذلك التصفيح الخلوية الشاذة والهجرة. نحن هنا نورد ككل يزدرع نصف الكرة المخية نظام لدراسات التنمية في وقت مبكر القشرية التي هي أسهل لإعداد شرائح من القشرية وعروض الهجرة عضوي النمط ثابت والتصفيح. في هذا النظام النموذجي، التصفيح المبكر وأنماط الهجرة بشكل طبيعي لمدة يومين في المختبر، بما في ذلك فترة تقسيم preplate خلالها طبقة قشرية المحتملين ستة أشكال. ونحن بعد ذلك وضعت الصعق الكهربائي الرحم EX (EUEP)النهج الذي يحقق النجاح ~ 80٪ في استهداف التعبير GFP إلى الخلايا العصبية في القشرة النامية الإنسي الظهرية.
ويزدرع نصف الكرة كله يجعل من تطوير نموذج القشرية في وقت مبكر للوصول للتدخل، الصعق الكهربائي الدوائية والنهج التصوير الحية. هذا الأسلوب يتجنب الجراحة المطلوبة من البقاء على قيد الحياة في الرحم الصعق الكهربائي (IUEP) النهج مع تحسين كل من ترنسفكأيشن والمساحي الاتساق الاستهداف. وهذه الطريقة تسهل من الدراسات التجريبية العصبية الهجرة، والانتشار والتمايز.
Introduction
والثدييات أشكال قشرة الدماغ من خلال الهجرة متضافرة، والانتشار والتمايز للخلايا العصبية ولدت على التوالي. ولادة كل الخلايا العصبية في منطقة البطين (VZ) ويهاجر من VZ إلى منطقة وسيطة (IZ)، وتشكيل لوحة القشرية (CP) 1. لأنها تمر من خلال المجالات المختلفة القشرية، الخلايا العصبية المهاجرة عرض وسائط متعددة من الهجرة 2،3 التي تعتمد على البيئة خارج الخلية والعناصر الخلوية الأخرى (مثل الخلايا الدبقية شعاعي) داخل الأنسجة النامية. الخلايا العصبية القشرية اعتقال ثم الترحيل في الجزء العلوي من لوحة لتشكيل القشرية في عمليات الاعتقال تتزامن الهجرة العصبية و 4 dendritogenesis.
يبدأ التنمية القشرية بين 11-13 يوما الجنينية (E11-13) من 5 إلى إنشاء طبقة ضفيري البدائية 6 أو preplate (PP)، طبقة من الخلايا العصبية التي يعتلي رائدة في VZ. محتملطبقة 6 الخلايا العصبية القشرية (أي الخلايا العصبية القشرية 1 لدت في VZ) ثم توجيه بهم somata في نمط النمطية ويندمج في طبقة متميزة في PP 7. تقسيم هذه الأحداث إلى preplate (طبقة المستقبل القشرية 1) هامشية سطحية وعميقة منطقة، وهذا الأخير يتألف من خلايا subplate (طبقة قشرية عابرة 7). هذه العملية، تسمى تقسيم preplate، هو حدث تأسيسي في النمو المستقبلي للقشرة الدماغ 8.
وقد تم تحديد العديد من الطفرات الوراثية التي تعطل مختلف جوانب التنمية القشرية 9. ويمكن أيضا أن تتأثر التنمية القشرية سلبا التعرض للسموم بلعها مثل الكوكايين 10 و الكحول 11. لأن التشوهات القشرية التي تنشأ خلال التنمية هي من المساهمين المحتمل أن الاضطرابات العصبية (مثل التوحد وانفصام الشخصية)، والتحقيقات التجريبية للاضطرابات في التنمية القشرية متأصلةالمهم لي. ولذلك من الأهمية بمكان وضع نهج لدراسة التنمية القشرية التي تسمح المقايسات السريع للآثار السمية الوراثية أو التي تحفظ ولكن أيضا التفاعلات الممكنة بين الخلايا العصبية التمييز، وغيرها من أنواع الخلايا المصفوفة خارج الخلية (ECM) خلال هذه الفترة المبكرة من نمو الدماغ 12 .
وقد وفرت إإكسبلنتس شريحة 13 مثل هذا النظام واستخدمت على نطاق واسع في التنمية فحص الخلايا العصبية القشرية 14-16. ومع ذلك، يمكن المقايسات شريحة تعاني من عيب أن الهجرة العصبية ويمكن أن يكون غير طبيعي التصفيح 17 ربما بسبب الضرر الذي يلحق الخلايا السحائي التي تحيط الدماغ النامية ومرساة وشعاعي الدبقية سقالة. كما قد الدبقية الألياف الشعاعية هي الركيزة الهامة لتعطيل الخلايا العصبية القشرية 18 الهجرة من الصفيحة القاعدية عن طريق تشريح تعطيل محليا العمارة الدبقية شعاعي وتؤدي إلى الهجرة القشرية تغييرها. وبالإضافة إلى ذلك سليدائرة الهندسة المدنية من السطوح إإكسبلنتس يوفر المنطقة من الخلايا الميتة التي قد تغير من تركيبة طبيعية من ECM في هذه المجالات.
وقد ركزت المناهج الأكثر حداثة تحليلهم على خلايا تقع في عمق شريحة التي تحيط بها أنواع الخلايا المناسبة صحية وECM. ومع ذلك، في بعض الحالات يمكن لهذه المناهج الجديدة تتطلب أن شريحة المثقفين الأصلي سميكة يكون البرد مقطوع مقطوع أو البارافين، بعد التثبيت بحيث يتم الداخلية عادية نسبيا من شريحة المتاحة للتحليل 19-21. كل من vibratome الأصلي تقطيع لإعداد شرائح حية للثقافة وكذلك cryosectioning اللاحقة من شرائح محددة للتحليل تتطلب الرعاية والجهد لهذه المقايسات للعمل.
لتوفير بسيطة، نهج تكميلية لدراسات التنمية القشرية في وقت مبكر، وقمنا بتعديل النهج القائمة شريحة 13 إلى تسهيل الدراسات القشرية للتنمية في وقت مبكر. وقد وضعنا WHأوله نموذج يزدرع نصف الكرة مماثلة لنموذج موجود E14 نصف الكرة بأكملها التي تشارك الثقافات تهز في 65 دورات في الدقيقة والنمو عضوي النمط يسمح ل16-18 ساعة 22،23. في نهجنا، يتم وضع إإكسبلنتس نصف الكرة كله على غشاء شبه منفذ 13 مع الأكسجين في جو الثقافة العالية 21،24 تمديد نمو عضوي النمط القشرية لمدة 48 ساعة. هذا النهج يسمح أيضا الصعق الكهربائي ثابت من الخلايا العصبية النامية القشرية. تتم إزالة الأجنة من الرحم وelectroporated DNA البلازميد لإدخال ويتم تشريح الدماغ الانتهائي ثم. يتم عزل كل نصف الكرة ووضعها أسفل على الجانب الإنسي مرشح الكولاجين المغلفة. ويستزرع ثم يزدرع لمدة 48 ساعة، وهي الفترة التي تشمل تقسيم preplate 8. خلال الفترة الثقافة، L6 الخلايا العصبية من تطوير الخلايا العصبية مقدمة لتمييز 25، صحيح داخل لوحة القشرية. طوال هذه الفترة الناميةوتحيط الخلايا العصبية من قبل ECM المناسبة والتي من شأنها أن أنواع الخلايا مواجهة الخلية المقابلة في الجسم الحي. وقد أثبت هذا النظام بالفعل قيمة في فك رموز أحداث الخلوية التي تكمن وراء سمية الإيثانول 26، وتشكيل طبقة 6 preplate تقسيم 7،25.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد قمنا بتحسين وتقييم نموذج تجريبي – إإكسبلنتس نصف الكرة كله – لدراسة التنمية القشرية في وقت مبكر (E13 E15-). أثبت نموذجا مفيدا لتحليل الهجرة وتمايز الخلايا العصبية من نسب مثير تشكل طبقة 6 من قشرة الدماغ 25،37. مزايا مبدأ النظام هي 1) النمو عضوي النمط لمدة 2 DIV، 2) إعداد ب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح NINDS (NS066071) وNIAAA و. (P50AA017823) لECO. الكتاب أشكر الدكتور روبرت كوين والموظفين في وزارة الثروة الحيوانية مختبر لرعاية الحيوانات. نشكر جودسون بلمونت حصول على الدعم الفني، نيكول Belletier للمساعدة على أنه باحث الصيفية الجامعية (SURF). نشكر أيضا الدكتور ديفيد كاميرون للتعليق عليها وتعديلات على إصدار سابق من المخطوطة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments (optional) |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 + GlutaMAX | GIBCO | 10565 | |
| G5 Supplement 100X | Invitrogen | 17503-012 | |
| B27 Serum-Free Suppl. 50X | Invitrogen | 1504-044 | |
| Pen / Strep Liquid 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| HBSS 500 ml | GIBCO | 14025 | |
| Culture insert collagen coated | Costar | 3492 | |
| Bovine skin gelatin | Sigma | G9382 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 7906 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Equipment | |||
| BTX 830 Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Tweezer electrodes 10mm | Harvard Apparatus | 450166 | |
| Incubator | Billups Rothenberg | MIC-101 | |
| Hamilton syringe (5 uL) | Hamilton | 87930 | |
| Hamilton syringe needle | Hamilton | 7803-04 | Specify 1″ and style 4 |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11251-10 | |
| Fine Scissors Tough Cut 9 cm | FST | 14058-09 |
References
- Rakic, P. Principles of neural cell migration. Experientia. 46, 882-891 (1990).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J. Neurosci. 23, 9996-10001 (2003).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. , (2004).
- Olson, E. C., Kim, S., Walsh, C. A. Impaired neuronal positioning and dendritogenesis in the neocortex after cell-autonomous Dab1 suppression. J. Neurosci. 26, 1767-1775 (2006).
- Takahashi, T., Goto, T., Miyama, S., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Sequence of neuron origin and neocortical laminar fate: relation to cell cycle of origin in the developing murine cerebral wall. J. Neurosci. 19, 10357-10371 (1999).
- Marin-Padilla, M. Early prenatal ontogenesis of the cerebral cortex (neocortex) of the cat (Felis domestica). A Golgi study. I. The primordial neocortical organization. Z. Anat. Entwicklungsgesch. 134, 117-145 (1971).
- Nichols, A. J., Olson, E. C. Reelin promotes neuronal orientation and dendritogenesis during preplate splitting. Cerebral Cortex. 20, 2213-2223 (2010).
- Sheppard, A. M., Pearlman, A. L. Abnormal reorganization of preplate neurons and their associated extracellular matrix: an early manifestation of altered neocortical development in the reeler mutant mouse. J. Comp. Neurol. 378, 173-179 (1997).
- Manzini, M. C., Walsh, C. A. What disorders of cortical development tell us about the cortex: one plus one does not always make two. Current Opinion in Genetics & Development. 21, 333-339 (2011).
- Jones, L., Fischer, I., Levitt, P. Nonuniform alteration of dendritic development in the cerebral cortex following prenatal cocaine exposure. Cereb. Cortex. 6, 431-445 (1996).
- Olney, J. W. Fetal alcohol syndrome at the cellular level. Addict. Biol. 9, 137-149 (2004).
- Levitt, P., Reinoso, B., Jones, L. The critical impact of early cellular environment on neuronal development. Prev. Med. 27, 180-183 (1998).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- O’Rourke, N. A., Dailey, M. E., Smith, S. J., McConnell, S. K. Diverse migratory pathways in the developing cerebral cortex. Science. 258, 299-302 (1992).
- Elias, L. A., Wang, D. D., Kriegstein, A. R. Gap junction adhesion is necessary for radial migration in the neocortex. Nature. 448, 901-907 (2007).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Muller, U. Reelin regulates cadherin function via Dab1/Rap1 to control neuronal migration and lamination in the neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gotz, M., Bolz, J. Formation and preservation of cortical layers in slice cultures. J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).
- Cameron, R. S., Rakic, P. Identification of membrane proteins that comprise the plasmalemmal junction between migrating neurons and radial glial cells. J Neurosci. 14, 3139-3155 (1994).
- Lizarraga, S. B., Coser, K. R., Sabbagh, M., Morrow, E. M. Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex. J. Vis. Exp. (63), e3621 (2012).
- Jossin, Y., Goffinet, A. M. Reelin signals through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt to control cortical development and through mTor to regulate dendritic growth. Mol. Cell Biol. 27, 7113-7124 (2007).
- Jossin, Y., Ogawa, M., Metin, C., Tissir, F., Goffinet, A. M. Inhibition of SRC family kinases and non-classical protein kinases C induce a reeler-like malformation of cortical plate development. J. Neurosci. 23, 9953-9959 (2003).
- Kingsbury, M. A., Rehen, S. K., Contos, J. J., Higgins, C. M., Chun, J. Non-proliferative effects of lysophosphatidic acid enhance cortical growth and folding. Nat. Neurosci. 6, 1292-1299 (2003).
- Rehen, S. K., et al. A new method of embryonic culture for assessing global changes in brain organization. J. Neurosci. Methods. 158, 100-108 (2006).
- Jossin, Y., et al. The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 24, 514-521 (2004).
- O’Dell, R. S., et al. Layer 6 cortical neurons require Reelin-Dab1 signaling for cellular orientation, Golgi deployment, and directed neurite growth into the marginal zone. Neural. Dev. 7, 25 (2012).
- Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ethanol-induced disruption of Golgi apparatus morphology, primary neurite number and cellular orientation in developing cortical neurons. Alcohol. , (2012).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 16-22 (2004).
- Suter, B., Nowakowski, R. S., Bhide, P. G., Caviness, V. S. Navigating neocortical neurogenesis and neuronal specification: a positional information system encoded by neurogenetic gradients. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of The Society for Neuroscience. 27, 10777-10784 (2007).
- Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J. Neurosci. 25, 247-251 (2005).
- Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo. Genesis. 45, 208-217 (2007).
- Pearlman, A. L., Sheppard, A. M. Extracellular matrix in early cortical development. Prog. Brain Res. 108, 117-134 (1996).
- Milev, P., et al. Differential regulation of expression of hyaluronan-binding proteoglycans in developing brain: aggrecan, versican, neurocan, and brevican. Biochemical and Biophysical Research Communications. 247, 207-212 (1998).
- Kwan, K. Y., et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 16021-16026 (2008).
- McKenna, W. L., et al. Tbr1 and Fezf2 regulate alternate corticofugal neuronal identities during neocortical development. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 549-564 (2011).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J. Neurosci. 30, 7028-7036 (2010).
- Powrozek, T. A., Zhou, F. C. Effects of prenatal alcohol exposure on the development of the vibrissal somatosensory cortical barrel network. Brain Res. Dev. Brain Res. 155, 135-146 (2005).
- O’Dell, R., et al. . Society for Neuroscience. , (2011).
- Tombol, T., Hajdu, F., Somogyi, G. Identification of the Golgi picture of the layer VI cortic-geniculate projection neurons. Experimental Brain Research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation Cerebrale. 24, 107-110 (1975).
- Brumberg, J. C., Hamzei-Sichani, F., Yuste, R. Morphological and physiological characterization of layer VI corticofugal neurons of mouse primary visual cortex. Journal of Neurophysiology. 89, 2854-2867 (2003).
- Jones, E. G. Synchrony in the interconnected circuitry of the thalamus and cerebral cortex. Annals of the New York Academy of Sciences. 1157, 10-23 (2009).
- Kowalczyk, T., et al. Intermediate Neuronal Progenitors (Basal Progenitors) Produce Pyramidal-Projection Neurons for All Layers of Cerebral Cortex. Cereb. Cortex. , (2009).
- Konig, N., Roch, G., Marty, R. The onset of synaptogenesis in rat temporal cortex. Anatomy and Embryology. 148, 73-87 (1975).
