Eski utero Elektroporasyon ve Tüm Yarımküre Eksplantlarından: Erken Kortikal Kalkınma Çalışmaları İçin Basit Bir Deney Yöntemi
Summary
Bu protokol içerir geliştirilmiş bir eksplant yordam açıklanır<em> Ex utero</em> Embriyonik fare genelinde hemisferlerin elektroporasyon, diseksiyon ve kültür. Hazırlanması erken kortikal gelişim sırasında gen fonksiyonu farmakolojik çalışmalar ve testler kolaylaştırır.
Abstract
Kortikal gelişme nöronlar ve öncü hücreleri, kan damarları, zarları ve ilişkili ekstrasellüler matriks içeren nöronal olmayan elemanlar arasındaki karmaşık etkileşimleri içerir. Onlar uygun bir organotipik ortamı sağlamak için, kortikal dilim eksplantlar genellikle nöronal farklılaşma ve gelişimini kontrol bu etkileşimlerin araştırılması için kullanılır. Yararlı olsa da, dilim eksplant modeli aberan hücresel laminasyon ve göç gibi sakıncaları muzdarip olabilir. Burada kortikal dilimleri ve gösterileri tutarlı organotipik göç ve laminasyon daha hazırlamak kolaydır erken kortikal gelişim çalışmaları için bir bütün serebral hemisfer eksplant sistemi rapor. Bu model sistem, erken laminasyon ve göç yollarını, preplate bölme dönemi de dahil olmak üzere, in vitro iki günlük bir süre için normal prospektif kortikal tabaka boyunca altı formları devam edin. Biz o eski utero elektroporasyon (EUEP) geliştirdidorsal medial korteks gelişen nöronlar GFP hedefleme ~% 80 başarı elde yaklaşım.
Bütün yarımkürede eksplant modeli elektroporasyon, farmakolojik müdahale ve canlı görüntüleme yaklaşımları için erişilebilir erken kortikal gelişim yapar. Bu yöntem transfeksiyon ve alansal hedefleme tutarlılığı hem artırırken utero elektroporasyon (IUEP) yaklaşımlar gerekli sağkalım cerrahi önler. Bu yöntem nöronal proliferasyon, göç ve farklılaşma deneysel çalışmalar kolaylaştıracaktır.
Introduction
Gittikçe üretilen nöronların uyumlu proliferasyon, göç ve farklılaştırılması yoluyla memeli serebral korteks formları. Her bir nöron ventriküler zonunda (VZ) doğdu ve kortikal plaka (CP) 1 oluşturan, ara bölge (IZ) içine VZ göç ediyor. Edilir Onlar farklı kortikal alanları geçerken, göç nöronlar gelişmekte doku içindeki ekstraselüler çevre ve diğer hücresel elementler (örneğin radyal glia) bağlıdır göç 2,3 çoklu ekran modları. Kortikal nöronlarda sonra nöronal göç yakalanması ve dendritogenesis 4 çakışık süreçlerinde şekillendirme kortikal plaka üstünde göç tutukla.
Kortikal gelişme embriyonik gün ilkel pleksiform tabakada 6 veya preplate (PP), o örter VZ öncü nöron tabakası kurulması yoluyla 11-13 (E11-13) 5 ile başlatılır. MuhtemelSonra katman 6 kortikal nöronların (VZ doğumlu yani ilk kortikal nöronlar) şark onların basmakalıp bir desen somata ve PP 7 içinde ayrı bir tabaka halinde birleşme. Bu olaylar bir yüzeysel marjinal (gelecek kortikal tabaka 1) ve derin bölge subplate hücreleri (geçici kortikal tabaka 7) oluşan ikinci içine preplate bölünmüş. Bu süreç, preplate yarma adlandırılan, serebral korteks 8 gelecekteki büyüme temel bir olaydır.
Pek çok genetik mutasyonlar kortikal geliştirme 9 çeşitli yönlerini bozan olduğu tespit edilmiştir. Kortikal gelişimi de olumsuz gibi kokain 10 ve alkol 11 olarak yutulur toksinler tarafından etkiledi olabilir. Gelişimi sırasında ortaya çıkan kortikal malformasyonlar nörolojik bozukluklar (örneğin otizm, şizofreni) muhtemelen katkıda olduğundan, kortikal gelişim için pertürbasyonların ampirik araştırmalar doğasında vardırönemli ly. Genetik ya da toksin etkilerinin hızlı testler izin değil, aynı zamanda beyin gelişimi 12 bu erken dönemde ayırt nöronlar, diğer hücre türleri ve ekstrasellüler matriks (ECM) arasındaki olası etkileşimler koruyan kortikal gelişim eğitim yaklaşımları kurmaya büyük önem taşımaktadır .
Dilim eksplantları 13 böyle bir sistemi temin olan ve yaygın olarak tahlil kortikal Nöron gelişme 14-16 için kullanılmıştır. Ancak, dilim deneyleri nöronal migrasyon ve laminasyon muhtemelen gelişmekte olan beyin ve çapa radyal glial iskele çevreleyen meningeal hücreler hasar nedeniyle 17 anormal olabilir dezavantajı muzdarip olabilir. Radyal glial lifler dilimleme bazal lamina kortikal nöron göçü 18 kesinti için önemli bir substrat olarak yerel radyal glial mimarisi bozabilir ve altere kortikal göç yol açabilir. Buna ek olarak slieksplant ced yüzeyleri bu alanlarda ECM normal kompozisyonu değiştirebilir ölü hücrelerin bir bölge sağlar.
Daha yeni yaklaşımlar uygun sağlıklı hücre tipleri ve ECM çevrili dilim derin yerleşimli hücrelerin üzerinde kendilerine analizi odaklanmıştır. Ancak, bazı durumlarda bu yeni yaklaşımların dilim nispeten normal iç analizi 19-21 için uygun hale getirilir, böylece orijinal kalın kültürlü dilim fiksasyon sonra kriyo-kesitli veya parafin-kesitli olmasını gerektirebilir. Kültür gibi analiz için sabit dilimlerin sonraki cryosectioning için canlı dilimleri hazırlamak için kesit orijinal vibratome Her ikisi de bu deneyler için çaba ve dikkat çalışma gerektirir.
Erken kortikal gelişim çalışmaları için basit, tamamlayıcı bir yaklaşım sağlamak için, biz erken kortikal gelişim çalışmalarını kolaylaştırmak için varolan bir dilim yaklaşımlar 13 değiştirdiniz. Biz bir wh geliştirdik65 dakikadaki dönüş ve 16-18 saat 22,23 için izin organotipik büyümeyi sallayarak kültürleri dahil varolan E14 bütün yarımkürede modeline benzer ole yarımkürede eksplant modeli. Bizim yaklaşım, bütün yarımkürede eksplantlar 48 saat süreyle organotipik kortikal büyüme genişletmek için yüksek oksijen kültür atmosferi 21,24 içinde yarı geçirgen bir zar 13 yerleştirilir. Bu yaklaşım, aynı zamanda kortikal nöronlarda geliştirilmesi tutarlı elektroporasyon için olanak sağlar. Embriyolar rahim kaldırılır ve plazmid DNA tanıtmak electroporated ve telencephalon sonra disseke edilir edilir. Her hemisfer izole ve kollajen kaplı filtre üzerinde medial yüzü aşağı yerleştirilir. Eksplant sonra 48 saat, preplate yarma 8 kapsayan bir dönem bir süre için yetiştirilir. Kültür döneminde, L6 nöronlar kortikal plağındaki doğru konumlandırılmış farklılaşmış nöron 25 habercisidir gelişir. Bu dönemde gelişmekte boyuncanöron in vivo olarak buna karşılık gelen hücre karşısına uygun ECM ve hücre türleri tarafından çevrelenmiştir. Bu sistem zaten etanol toksisitesi 26 kat 6 oluşumu ve preplate bölme 7,25 altında yatan hücresel olayları çözmekte değerli kanıtlamıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz gelişmiş ve deneysel modelini değerlendirdi – Bütün yarımkürede eksplantlar – erken kortikal gelişim çalışması için (E13-E15). Modeli serebral korteks 25,37 tabaka 6 teşkil eksitatör nöron soy göç ve farklılaşma analizi için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Sistemin prensibi avantajları hazırlık sadeliği ve beyin gelişiminin bu erken, kritik döneminde elektroporasyon, Farmakolojik manipulasyon ve görüntüleme için nöronlara 3) deneysel erişim)) 2 DIV organotipik büyüm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser NINDS (NS066071) ve NIAAA hibe desteklenmiştir. (P50AA017823) ECO. Yazarlar, Dr Robert Quinn ve hayvan bakımı Laboratuar Hayvan Kaynakları Bölümü personel teşekkür. Biz Yaz Lisans Araştırma Görevlisi (SURF) gibi yardım için, teknik destek için Nicole Belletier Judson Belmont ederim. Biz de yorum yapmak için Dr David Cameron teşekkür yazının önceki bir sürümünde düzenler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments (optional) |
| Reagents | |||
| DMEM/F12 + GlutaMAX | GIBCO | 10565 | |
| G5 Supplement 100X | Invitrogen | 17503-012 | |
| B27 Serum-Free Suppl. 50X | Invitrogen | 1504-044 | |
| Pen / Strep Liquid 100X | Invitrogen | 15140-122 | |
| HBSS 500 ml | GIBCO | 14025 | |
| Culture insert collagen coated | Costar | 3492 | |
| Bovine skin gelatin | Sigma | G9382 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | 7906 | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Equipment | |||
| BTX 830 Electroporator | Harvard Apparatus | 450052 | |
| Tweezer electrodes 10mm | Harvard Apparatus | 450166 | |
| Incubator | Billups Rothenberg | MIC-101 | |
| Hamilton syringe (5 uL) | Hamilton | 87930 | |
| Hamilton syringe needle | Hamilton | 7803-04 | Specify 1″ and style 4 |
| Dumont #5 Forceps | FST | 11251-10 | |
| Fine Scissors Tough Cut 9 cm | FST | 14058-09 |
References
- Rakic, P. Principles of neural cell migration. Experientia. 46, 882-891 (1990).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J. Neurosci. 23, 9996-10001 (2003).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat. Neurosci. , (2004).
- Olson, E. C., Kim, S., Walsh, C. A. Impaired neuronal positioning and dendritogenesis in the neocortex after cell-autonomous Dab1 suppression. J. Neurosci. 26, 1767-1775 (2006).
- Takahashi, T., Goto, T., Miyama, S., Nowakowski, R. S., Caviness, V. S. Sequence of neuron origin and neocortical laminar fate: relation to cell cycle of origin in the developing murine cerebral wall. J. Neurosci. 19, 10357-10371 (1999).
- Marin-Padilla, M. Early prenatal ontogenesis of the cerebral cortex (neocortex) of the cat (Felis domestica). A Golgi study. I. The primordial neocortical organization. Z. Anat. Entwicklungsgesch. 134, 117-145 (1971).
- Nichols, A. J., Olson, E. C. Reelin promotes neuronal orientation and dendritogenesis during preplate splitting. Cerebral Cortex. 20, 2213-2223 (2010).
- Sheppard, A. M., Pearlman, A. L. Abnormal reorganization of preplate neurons and their associated extracellular matrix: an early manifestation of altered neocortical development in the reeler mutant mouse. J. Comp. Neurol. 378, 173-179 (1997).
- Manzini, M. C., Walsh, C. A. What disorders of cortical development tell us about the cortex: one plus one does not always make two. Current Opinion in Genetics & Development. 21, 333-339 (2011).
- Jones, L., Fischer, I., Levitt, P. Nonuniform alteration of dendritic development in the cerebral cortex following prenatal cocaine exposure. Cereb. Cortex. 6, 431-445 (1996).
- Olney, J. W. Fetal alcohol syndrome at the cellular level. Addict. Biol. 9, 137-149 (2004).
- Levitt, P., Reinoso, B., Jones, L. The critical impact of early cellular environment on neuronal development. Prev. Med. 27, 180-183 (1998).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
- O’Rourke, N. A., Dailey, M. E., Smith, S. J., McConnell, S. K. Diverse migratory pathways in the developing cerebral cortex. Science. 258, 299-302 (1992).
- Elias, L. A., Wang, D. D., Kriegstein, A. R. Gap junction adhesion is necessary for radial migration in the neocortex. Nature. 448, 901-907 (2007).
- Franco, S. J., Martinez-Garay, I., Gil-Sanz, C., Harkins-Perry, S. R., Muller, U. Reelin regulates cadherin function via Dab1/Rap1 to control neuronal migration and lamination in the neocortex. Neuron. 69, 482-497 (2011).
- Gotz, M., Bolz, J. Formation and preservation of cortical layers in slice cultures. J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).
- Cameron, R. S., Rakic, P. Identification of membrane proteins that comprise the plasmalemmal junction between migrating neurons and radial glial cells. J Neurosci. 14, 3139-3155 (1994).
- Lizarraga, S. B., Coser, K. R., Sabbagh, M., Morrow, E. M. Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex. J. Vis. Exp. (63), e3621 (2012).
- Jossin, Y., Goffinet, A. M. Reelin signals through phosphatidylinositol 3-kinase and Akt to control cortical development and through mTor to regulate dendritic growth. Mol. Cell Biol. 27, 7113-7124 (2007).
- Jossin, Y., Ogawa, M., Metin, C., Tissir, F., Goffinet, A. M. Inhibition of SRC family kinases and non-classical protein kinases C induce a reeler-like malformation of cortical plate development. J. Neurosci. 23, 9953-9959 (2003).
- Kingsbury, M. A., Rehen, S. K., Contos, J. J., Higgins, C. M., Chun, J. Non-proliferative effects of lysophosphatidic acid enhance cortical growth and folding. Nat. Neurosci. 6, 1292-1299 (2003).
- Rehen, S. K., et al. A new method of embryonic culture for assessing global changes in brain organization. J. Neurosci. Methods. 158, 100-108 (2006).
- Jossin, Y., et al. The central fragment of Reelin, generated by proteolytic processing in vivo, is critical to its function during cortical plate development. J. Neurosci. 24, 514-521 (2004).
- O’Dell, R. S., et al. Layer 6 cortical neurons require Reelin-Dab1 signaling for cellular orientation, Golgi deployment, and directed neurite growth into the marginal zone. Neural. Dev. 7, 25 (2012).
- Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ethanol-induced disruption of Golgi apparatus morphology, primary neurite number and cellular orientation in developing cortical neurons. Alcohol. , (2012).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 16-22 (2004).
- Suter, B., Nowakowski, R. S., Bhide, P. G., Caviness, V. S. Navigating neocortical neurogenesis and neuronal specification: a positional information system encoded by neurogenetic gradients. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of The Society for Neuroscience. 27, 10777-10784 (2007).
- Englund, C., et al. and Tbr1 are expressed sequentially by radial glia, intermediate progenitor cells, and postmitotic neurons in developing neocortex. J. Neurosci. 25, 247-251 (2005).
- Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo. Genesis. 45, 208-217 (2007).
- Pearlman, A. L., Sheppard, A. M. Extracellular matrix in early cortical development. Prog. Brain Res. 108, 117-134 (1996).
- Milev, P., et al. Differential regulation of expression of hyaluronan-binding proteoglycans in developing brain: aggrecan, versican, neurocan, and brevican. Biochemical and Biophysical Research Communications. 247, 207-212 (1998).
- Kwan, K. Y., et al. SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 16021-16026 (2008).
- McKenna, W. L., et al. Tbr1 and Fezf2 regulate alternate corticofugal neuronal identities during neocortical development. The Journal of Neuroscience : The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 549-564 (2011).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Stancik, E. K., Navarro-Quiroga, I., Sellke, R., Haydar, T. F. Heterogeneity in ventricular zone neural precursors contributes to neuronal fate diversity in the postnatal neocortex. J. Neurosci. 30, 7028-7036 (2010).
- Powrozek, T. A., Zhou, F. C. Effects of prenatal alcohol exposure on the development of the vibrissal somatosensory cortical barrel network. Brain Res. Dev. Brain Res. 155, 135-146 (2005).
- O’Dell, R., et al. . Society for Neuroscience. , (2011).
- Tombol, T., Hajdu, F., Somogyi, G. Identification of the Golgi picture of the layer VI cortic-geniculate projection neurons. Experimental Brain Research. Experimentelle Hirnforschung. Experimentation Cerebrale. 24, 107-110 (1975).
- Brumberg, J. C., Hamzei-Sichani, F., Yuste, R. Morphological and physiological characterization of layer VI corticofugal neurons of mouse primary visual cortex. Journal of Neurophysiology. 89, 2854-2867 (2003).
- Jones, E. G. Synchrony in the interconnected circuitry of the thalamus and cerebral cortex. Annals of the New York Academy of Sciences. 1157, 10-23 (2009).
- Kowalczyk, T., et al. Intermediate Neuronal Progenitors (Basal Progenitors) Produce Pyramidal-Projection Neurons for All Layers of Cerebral Cortex. Cereb. Cortex. , (2009).
- Konig, N., Roch, G., Marty, R. The onset of synaptogenesis in rat temporal cortex. Anatomy and Embryology. 148, 73-87 (1975).
