Новорожденных субвентрикулярной Electroporation зоны
Summary
Мы демонстрируем минимально инвазивной техники называют новорожденных субвентрикулярной электропорации зоне. Методика заключается во введении плазмидной ДНК в боковых желудочков у новорожденных щенков и применение электрического тока для доставки и генетически манипулировать нервных стволовых клеток
Abstract
Нервные стволовые клетки (НСК) линии послеродового боковых желудочков и приводит к нескольким типам клеток, которые включают нейроны, астроциты и клетки эпендимных 1. Понимание молекулярных путей, ответственных за НСК самообновлению, целеустремленность и дифференциация имеет решающее значение для освоения их уникальные возможности для восстановления мозга и лучше понять расстройства центральной нервной системы. Предыдущие методы манипуляции системах млекопитающих требуется много времени и средств деятельности генной инженерии в целом уровень животного 2. Таким образом, подавляющее большинство исследований изучили функции молекулы НСК в пробирке или в беспозвоночных.
Здесь мы покажем, простой и быстрый метод управления новорожденных NPCs, что называют новорожденных субвентрикулярной зону (СВЗ) электропорации. Подобные методы были разработаны десять лет назад для изучения эмбриональных НСК и помогли исследования по corticaл развитие 3,4. Совсем недавно это был применен для изучения послеродовой мозга грызунов 5-7. Этот метод приводит к надежной маркировки SVZ НСК и их потомства. Таким образом, послеродовое SVZ электропорации предоставляет стоимость и время эффективной альтернативой для млекопитающих НСК генной инженерии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы подробно технику новорожденных электропорации SVZ, технику, быстро и надежно маркировать и манипулировать SVZ стволовых клеток и их потомства. Есть несколько преимуществ, которые электропорации имеет по сравнению с другими методами. Во-первых, учитывая координационного маркиро…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами от Министерства обороны (награда идея развития, W81XWH-10-1-0041, AB), CT стволовых клеток гранта (AB) и Национального института здоровья АЯРБ 10668225 (DMF). Настоящий материал основан на работе частично поддержана штата Коннектикут под сотовый Коннектикут стволовых Программа исследовательских грантов. Его содержание несут исключительно авторы и не обязательно отражают официальную точку зрения штата Коннектикут, Департамент здравоохранения штата Коннектикут или КТ Innovations, Inc спонсоры не играли никакой роли в разработке дизайна исследования, сбор данных и анализа, решение о публикации или подготовки рукописи.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Heavy Polished Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | BF150-110-10 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narishige | PC-10H | |
| Fast Green | Fischer Scientific | 0521192205 | |
| ECM 830 Square Wave Pulse generator | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| Tweezertrodes | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Tungsten Halogen lamp | USHIO America, Inc | 1002247 | |
| Picospritzer II | Parker Instruments | 052-0312-900 |
References
- Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. The glial nature of embryonic and adult neural stem cells. Annual Review of Neuroscience. 32, 149-184 (2009).
- Imayoshi, I., Sakamoto, M., Kageyama, R. Genetic methods to identify and manipulate newly born neurons in the adult brain. Frontiers in Neuroscience. 5, 64 (2011).
- LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, i120-i125 (2009).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103, 865-872 (2001).
- Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain. PloS ONE. 3, e1883 (2008).
- Chesler, A. T., et al. Selective gene expression by postnatal electroporation during olfactory interneuron nurogenesis. PloS ONE. 3, e1517 (2008).
- Platel, J. C., et al. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 73, 357-365 (2008).
- Fernandez, M. E., Croce, S., Boutin, C., Cremer, H., Raineteau, O. Targeted electroporation of defined lateral ventricular walls: a novel and rapid method to study fate specification during postnatal forebrain neurogenesis. Neural Development. 6, 13 (2011).
- de Chevigny, A., et al. miR-7a regulation of Pax6 controls spatial origin of forebrain dopaminergic neurons. Nature Neuroscience. 15, 1120-1126 (2012).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Frontiers in Neuroscience. 4, (2010).
- Feliciano, D. M., Quon, J. L., Su, T., Taylor, M. M., Bordey, A. Postnatal neurogenesis generates heterotopias, olfactory micronodules and cortical infiltration following single-cell Tsc1 deletion. Human Molecular Genetics. 21, 799-810 (2012).
- Iguchi, T., Yagi, H., Wang, C. C., Sato, M. A tightly controlled conditional knockdown system using the Tol2 transposon-mediated technique. PloS ONE. 7, e33380 (2012).
