유전자 인코딩 optogenetic 도구에서 특정 뉴런의 비 침투 조작을 수<em> Drosophila</em> 뇌. 이러한 도구는 해당 인증 특정 행동을 유도하거나 억제하기에 충분한 뉴런을 식별 할 수 있습니다. 여기 자유롭게 산책 파리의 대상 뉴런에 표시됩니다 Channelrhodopsin2를 활성화하기위한 방법을 제시한다.
유전자 인코딩 도구의 수가 증가하고 Drosophila melanogaster 1 특정 뉴런의 신경 활동의 비 침습적 조작을 허용 가능 해지고 있습니다. 이 중 최고는 밝은 빛을 사용하여 온전하고 자유롭게 움직이는 동물에서 특정 뉴런의 활성화 또는 입을 수 있도록 optogenetic 도구입니다. Channelrhodopsin (ChR2)는 푸른 빛에 의해 활성화 될 때를 표현 뉴런의 탈분극을 초래, 밝은 활성화 양이온 채널입니다. ChR2는 CO 2 회피, 코 확장 및 대형 섬유 매개 펄쩍 뛰게하다 응답 2-4과 같은 특정 행동에 대한 중요한 뉴런을 식별위한 효과적인 왔습니다. 그러나, 또한 ChR2을 자극 photoreceptors를 자극하는 데 사용되는 강렬한 광원으로,이 optogenetic 기술은 이전 영상 시스템에 사용되지 않았습니다. 여기, 우리는 데모로 phototransduction을 impairs 돌연변이로 optogenetic 접근 방식을 결합파리의 광 엽, Foma-1 뉴런의 직기에 민감한 뉴런의 클러스터의 활성화를 nstrate, 충돌을 피하기 위해 사용하는 탈출의 행동을 유도 할 수 있습니다. 우리는 phototransduction 층계의 중요한 구성 요소의 널 allele을 사용 norpA 유전자에 의해 인코딩 phospholipase C-β는 장님이 날아 렌더링하고 있으며, Foma-1 ChR2의 표현을 유도 할 Gal4-UAS 전사 활성 시스템을 사용하는 뉴런. 개별 파리는 푸른 LED가 둘러싸인 작은 플랫폼에 배치됩니다. LED가 조명 때, 시각적으로 구동 직기 – 탈출의 행동과 비슷한 방식으로, 비행으로 신속하게 이륙 이동합니다. 우리는이 기술을 쉽게 자유롭게 파리를 이동 다른 행동을 조사하도록 구성 될 수 있다고 생각합니다.
유전자 인코딩 도구의 성장 아스날이 Drosophila melanogaster 1 특정 셀의 신경 활동을 조작하기 위해 개발되었습니다. 이 도구는 온전하고 자유롭게 움직이는 동물에서 특정 뉴런의 비 침투 활성화 또는 입을 할 수 있습니다. 이 시간적으로 통제하고 빠르게 유도 할 수 있기 때문에이 중, Channelrhodopsin2 (ChR2), 빛 활성 양이온 채널, 주요 장점을 제공합니다. 경우 명시 적 ChR2은 그들이 빠르게 depolarize 3 ~ 5 높은 발사 속도를 나타내는 밝은 파란색 (470 nm 정도) 빛에 노출되는 뉴런. 자유롭게 움직이는 동물에서 특정 뉴런의 이러한 목표 활성화는 CO 2 회피 3, 코 확장 2,4, 그리고 거대한 섬유 매개 펄쩍 뛰게하다 응답 4와 같은 행위에 대한 특정 뉴런의 자족을 공개했다. 그러나, ChR2을 자극 할 필요가 강렬한 광원으로도 조합을 적용, photoreceptors을 자극시각 시스템에 togenetic 기술이 제한되었습니다. phototransduction을 impairs 돌연변이가있는 optogenetic 접근 방식을 결합하여, 우리는 파리의 광 엽의 뉴런의 특정 클러스터의 활성화가 충돌 6 방지하는 데 사용되는 탈출 행동을 유도 할 수있는 증명하고있다.
대부분 경우 모든 시각적 인 동물은 다가오는 객체와 충돌을 피하기 위해 탈출 행동을 나타냅니다. 나타난 충돌로 제시 할 때 파리를 산책하거나 고정, 멀리 다가오는 충돌 7-9에서 비행기로 이륙. 이러한 테이크 오프는 이륙과 불안정한 비행 궤적 10,11 이전 제기 날개를 특징으로하고 있습니다. 이 응답은 거대한 섬유 매개 펄쩍 뛰게하다 응답 제기 날개 앞에는되지 점프 별개이며, 일반적으로 자유 낙하 회전식 4,9의 결과. uniqu있는 광 엽, Foma-1 뉴런에 직기 민감한 뉴런의 특정 클러스터를 식별 것으로일리가 접근 객체를 인코딩 조정, 우리는 파리의 직기 이스케이프 동작에서의 참여를 조사 모색하고 있습니다. 여기 선택적으로 이러한 뉴런을 활성화하고 파리의 탈출 행동을 유도 할 수 optogenetics의 사용을 보여줍니다.
우리는 Foma-1 뉴런에 ChR2의 표현을 유도 할 Gal4-UAS 전사 활성 시스템을 사용합니다. ChR2는 cofactor는 모든 횡단 망막 필요하며이 작업은 Drosophila 중추 신경 시스템의 낮은 수준에서 발견됩니다로는 파리 '의 음식에 보충해야합니다. 밝은 빛이 ChR2를 활성화하는 데 사용되는 파리는 강력한 phototactic 행동을 전시하고 있습니다 3,4으로 12 우리는 자극에 대한 시각적 반응의 가능성을 제거하기 위해 모색하고 있습니다. 이 작업을 수행하려면, 우리는 phototransduction 층계의 중요한 구성 요소 phospholipase C-β를 인코딩 norpA 유전자의 null이 allele에 대한 homozygous 돌연변이했다 동물을 사용했습니다. 이러한 돌연변이 파리의 Photoreceptors는 책임을 할 수 없습니다d는 13 불입니다. 탈출 응답의 optogenetic 자극을 테스트하기 위해, 우리는 하나의 플라이를 분리하고 밝은 푸른 빛에 목욕을해야합니다. 이 작업을 수행하기 위해, 우리는 pipet 팁에서 개별 파리 배치합니다. 하나 pipet 팁은 파리가 geotactically 팁을 걸어 그러한와 아웃 사각형 플랫폼으로 사용자 정의 홀더에 배치됩니다. 파리가 자유롭게이 플랫폼의 상단에 돌아 다닐 할 수 있습니다. 플랫폼은 플랫폼의 상단에 초점을 맞춘 네 푸른 색 LED 배열, 각 포함 3 개의 LED로 둘러싸여 있습니다. 파리가 플랫폼에 후, LED를 조명하고 있으며, 파리의 응답은 고속 카메라 6을 사용하여 기록됩니다.
우리는 밝은 푸른 빛으로 파리를 도보로 자유롭게 수영하여 도망가는 방법을 optogenetic 자극을 보여주고 있습니다. 이 접근 방식은 쉽게 자유롭게 도보로 파리에서 다른 행동을 조사하도록 구성 할 수 있으며, 단순히 우리가 더 큰 영역 사용되는 LED 배열을 기와 지붕으로 더 큰 플랫폼으로 확장 할 수 있습니다. 사용자가 재단사, 우리가 설명 저렴한 카메라, 또는 기타 사용 가능한 카메라 시스…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 스탠포드 딘의 휄로 십 (SEJdV), 건강 감독 개척자 상 국립 연구소 (TRC DP0035350), 일행 재단 학술의 상 (TRC)와 R01 EY022638 (TRC)에 의해 재정 지원되었다.
Reagent | |||
All-trans Retinal | Advance Scientific & Chemical Inc | R3041 | |
Equipment | |||
Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
Snap-Loc Coolant Hose, ¼” ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼” NPT Male |
Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
Exilim camera | Casio | EX-FH20 |