Optogenetic تحفيز السلوك في الهروب<em> ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em
Summary
أدوات ترميز وراثيا optogenetic تمكين التلاعب موسع من الخلايا العصبية المحددة في<em> ذبابة الفاكهة</em> الدماغ. يمكن لهذه الأدوات تحديد الخلايا العصبية التي التنشيط كافية للحصول أو قمع السلوكيات معينة. هنا نقدم طريقة لتفعيل Channelrhodopsin2 التي يعبر عنها في الخلايا العصبية المستهدفة في الذباب المشي بحرية.
Abstract
وهناك عدد متزايد من الأدوات المشفرة وراثيا أصبحت المتاحة التي تسمح غير الغازية التلاعب في النشاط العصبي للخلايا العصبية الخاصة في ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا 1. ومن أهم هذه الأدوات هي optogenetic، والتي تتيح تفعيل أو إسكات من الخلايا العصبية المحددة في الحيوان سليمة والتحرك بحرية باستخدام الضوء الساطع. Channelrhodopsin (ChR2) هي قناة الموجبة للضوء المنشط أنه عندما تفعيلها من خلال الضوء الأزرق، وأسباب إزالة الاستقطاب من الخلايا العصبية التي تعبر عن ذلك. وكان ChR2 فعالة لتحديد الخلايا العصبية الحرجة لسلوكيات معينة، مثل تجنب 2 CO والإرشاد وخرطوم العملاقة الألياف بوساطة ردود الفعل المفاجئة 2-4. لكن، وكما تستخدم مصادر الضوء المكثف لتحفيز تحفيز خلايا مستقبلة للضوء ChR2 أيضا، لم هذه التقنيات optogenetic سبق المستخدمة في النظام البصري. هنا، ونحن الجمع بين نهج optogenetic مع الطفرة التي يضعف لphototransduction التجريبيnstrate أن تفعيل مجموعة من الخلايا العصبية الحساسة للتلوح في الأفق في الفص الذبابة البصرية، FOMA-1 الخلايا العصبية، يمكن أن تقود سلوك الهروب استخدامها لتجنب الاصطدام. كنا على أليل فارغة من عنصر حاسم من الشبكة phototransduction، فسفوليباز C-β، المشفرة بواسطة الجينات norpA، لجعل الذباب المكفوفين وأيضا استخدام Gal4-UAS نظام المنشط النسخي لدفع التعبير عن ChR2 في FOMA-1 الخلايا العصبية. توضع الذباب الفردية على منصة صغيرة محاطة المصابيح الزرقاء. عندما تضاء المصابيح، ويطير بسرعة الإقلاع في رحلة، بطريقة مشابهة لسلوك الهروب النول مدفوعة بصريا. ونحن نعتقد أن هذه التقنية يمكن تكييفها بسهولة لدراسة السلوكيات الأخرى في التحرك بحرية الذباب.
Introduction
وقد وضعت ترسانة متزايدة من الأدوات المشفرة وراثيا لمعالجة النشاط العصبي في خلايا معينة في ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا 1. هذه الأدوات تمكن تفعيل موسع أو إسكات من الخلايا العصبية المحددة في الحيوان سليمة وتتحرك بحرية. ومن بين هذه، Channelrhodopsin2 (ChR2)، قناة الموجبة للضوء المنشط، ويقدم المزايا الرئيسية، حيث يمكن أن تسيطر مؤقتا والتي يسببها بسرعة. عندما الخلايا العصبية التي يتعرض لها صريحة ChR2 إلى الضوء الساطع (470 نانومتر) الزرقاء التي تظهر بسرعة ويزيل الاستقطاب ارتفاعا في معدلات اطلاق 3-5. وقد كشفت هذه الخلايا العصبية المستهدفة تفعيل محددة في الحيوانات التحرك بحرية كفاية من الخلايا العصبية خاصة لتجنب السلوكيات مثل 2 CO 3، خرطوم تمديد 2،4، والألياف العملاقة الردود جفل بوساطة 4. لكن، وكما مصادر ضوء مكثفة اللازمة لتحفيز خلايا مستقبلة للضوء أيضا تحفيز ChR2، وتطبيق البروتوكول الاختياريكان محدودا لتقنيات togenetic النظام البصري. من خلال الجمع بين نهج optogenetic مع الطفرة التي يضعف phototransduction، وقد أثبتنا أن تفعيل مجموعة محددة من الخلايا العصبية في الفص الذبابة البصرية يمكن أن تدفع سلوك الهروب استخدامها لتجنب الاصطدام 6.
معظم، إن لم يكن كلها، والحيوانات البصرية يحمل سلوك الهروب لتجنب الاصطدامات مع كائنات قادمة في الاتجاه المعاكس. المشي أو ثابتة الذباب، عندما قدم مع حادث تصادم تلوح في الأفق، الإقلاع إلى الطائرة، بعيدا عن التصادم قدوم 7-9. وتتميز هذه الموازنة من قبل أخذها إلى أجنحة أثار قبل اقلاعها ومسار رحلة غير مستقرة 10،11. هذا الرد يختلف عن استجابة العملاقة الألياف بوساطة جفل، القفزات التي لا يسبقها أجنحة المثارة، ويؤدي عادة في تعثر السقوط الحر 4،9. وبعد تحديد مجموعة محددة من الخلايا العصبية الحساسة تلوح في الأفق في الفص البصري، FOMA-1 الخلايا العصبية، التي هي UNIQUسعينا اعل ضبطها لترميز الأشياء تقترب، لبحث مشاركتها في الذبابة تلوح في الأفق السلوك الهروب. نحن هنا لشرح استخدام optogenetics لتفعيل هذه الخلايا العصبية بشكل انتقائي وتثير السلوك الذبابة الهروب.
نستخدم نظام Gal4-UAS المنشط النسخي لدفع التعبير عن ChR2 في الخلايا العصبية-1 FOMA. ChR2 يتطلب العامل المساعد للجميع عبر الشبكية وكما تم العثور على هذا في مستويات منخفضة في النظام المركزي العصبي ذبابة الفاكهة يجب أن تستكمل في النظام الغذائي للذباب. 3،4 كما يتم استخدام الضوء الساطع لتفعيل ChR2 والذباب يحمل السلوكيات ضوئية السلوك قوية 12، سعينا إلى القضاء على إمكانية استجابة لحافز البصرية. للقيام بذلك، كنا الحيوانات التي كانت متحولة متماثلة اللواقح أليل لاغية من الجين norpA، الذي يشفر عنصر حاسم من الشبكة phototransduction، فسفوليباز C-β. مبصرات في الذباب متحولة غير قادر على مثل هذه المسؤولةد الضوء 13. لاختبار التحفيز optogenetic للاستجابة الهروب، ونحن بحاجة لعزل ذبابة واحدة ويستحم في ضوء زرقاء لامعة. للقيام بذلك، ونحن نضع الفرد في الذباب نصائح الماصة. يتم وضع طرف واحد الماصة في حامل مخصصة، مثل أن يطير سوف يسير geotactically حتى تلميح والخروج على منصة مستطيلة. الطاير قادرة على المشي بحرية حول على رأس هذا النظام الأساسي. وتحيط بها سلسلة منصة الزرقاء 4 الصمام، كل يحتوي على 3 المصابيح، وتركز على الجزء العلوي من المنصة. بعد الطاير على المنصة، والمصابيح مضاءة، ويتم تسجيل رد الذبابة باستخدام كاميرا عالية السرعة 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد أثبتنا التحفيز optogenetic من السلوكيات الهروب من الاستحمام بحرية المشي الذباب في ضوء زرقاء لامعة. يمكن تكييفها بسهولة هذا النهج لدراسة السلوكيات الأخرى في الذباب المشي بحرية، ويمكن زيادتها إلى أكبر منصات من قبل تبليط ببساطة صفائف LED كنا على مساحة أكبر. سواء باستخ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الزمالة وعميد جامعة ستانفورد في (SEJdV)، والمعاهد الوطنية للصحة جائزة الريادة المدير (TRC DP0035350)، جائزة مؤسسة ماكنايت الباحث في (TRC) وR01 EY022638 (TRC).
Materials
| Reagent | |||
| All-trans Retinal | Advance Scientific & Chemical Inc | R3041 | |
| Equipment | |||
| Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼” ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼” NPT Male |
| Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 |
References
- Venken, K., Simpson, J., Bellen, H. Genetic manipulations of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gordon, M., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Suh, G. S. B., et al. Light activation of an innate olfactory avoidance response in Drosophila. Current Biology. 17, 905-908 (2007).
- Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of Drosophila behaviors through Channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. European Journal of Neuroscience. 26, 2405-2416 (2007).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 13940-13945 (2003).
- de Vries, S., Clandinin, T. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Current Biology. 22, 353-362 (2012).
- Card, G. Escape behaviors in insects. Current Opinion in Neurobiology. 22, 1-7 (2012).
- Card, G., Dickinson, M. H. Visually mediated motor planning in the escape response of Drosophila. Current Biology. 18, 1300-1307 (2008).
- Fotowat, H., Fayyazuddin, A., Bellen, H. J., Gabbiani, F. A novel neuronal pathway for visually guided escape in Drosophila melanogaster. Journal of Neurophysiology. 102, 875-885 (2009).
- Card, G., Dickinson, M. H. Performance trade-offs in the flight initiation of Drosophila melanogaster. The Journal of Experimental Biology. 211, 341-353 (2008).
- Hammond, S., O’Shea, M. Escape flight initiation in the fly. Journal of Comparative Phsyiology A. 193, 471-476 (2007).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
- Bloomquist, B., et al. Isolation of a putative phospholipase C gene of Drosophila, norpA, and its role in phototransduction. Cell. 54, 723-733 (1988).
- Gohl, D., et al. A versatile in vivo system for directed dissection of gene expression patterns. Nature Methods. 8, 231-237 (2011).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox cateri. Nature Neuroscience. 11, 631-633 (2008).
