Stimulation optogenetic de comportement de fuite en<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Outils optogenetic génétiquement codés permettent une manipulation non invasive des neurones spécifiques dans le<em> Drosophila</em> Cerveau. Ces outils peuvent identifier les neurones dont l'activation est suffisante pour déclencher ou supprimer des comportements particuliers. Nous présentons ici une méthode pour activer Channelrhodopsin2 qui est exprimé dans les neurones ciblés chez les mouches librement à pied.
Abstract
Un nombre croissant d'outils codés génétiquement sont désormais disponibles qui permettent une manipulation non invasive de l'activité nerveuse des neurones spécifiques chez Drosophila melanogaster 1. Parmi ceux-ci sont des outils qui permettent optogenetic, l'activation ou inactivation des neurones spécifiques chez l'animal intact et se déplacer librement en utilisant une lumière vive. Channelrhodopsin (ChR2) est un canal cationique activé par la lumière qui, lorsqu'il est activé par la lumière bleue, provoque une dépolarisation des neurones qui l'expriment. ChR2 a été efficace pour identifier les neurones essentiels à des comportements spécifiques, tels que le CO 2 d'évitement, extension du proboscis et le géant en fibre de réaction de sursaut médiation 2-4. Cependant, comme les sources lumineuses intenses utilisées pour stimuler ChR2 également stimuler les photorécepteurs, ces techniques optogenetic n'ont pas déjà été utilisé dans le système visuel. Ici, nous combinons une approche optogenetic avec une mutation qui altère phototransduction à la démonstrate que l'activation d'un groupe de métier à tisser les neurones sensibles à lobe optique de la mouche, Foma-1 neurones, peut entraîner un comportement de fuite permet d'éviter une collision. Nous avons utilisé un allèle nul d'une composante essentielle de la cascade de phototransduction, la phospholipase C-β, codée par le gène NORPA, pour rendre les mouches aveugles et également utiliser le Gal4-UAS système activateur de la transcription pour diriger l'expression de ChR2 dans le Foma-1 neurones. Mouches individuels sont placés sur une petite plate-forme entourée de LED bleues. Lorsque les voyants sont allumés, la vole vite décoller en vol, d'une manière similaire à visuellement conduit métier-évasion comportement. Nous pensons que cette technique peut être facilement adapté à examiner les comportements des autres en se déplaçant librement mouches.
Introduction
Un arsenal de plus en plus d'outils génétiquement codés ont été développés pour manipuler l'activité neuronale dans des cellules spécifiques chez Drosophila melanogaster 1. Ces outils permettent l'activation non invasive ou réprimer des neurones spécifiques chez l'animal intact et libre de ses mouvements. Parmi ceux-ci, Channelrhodopsin2 (ChR2), un canal cationique activé par la lumière, offre des avantages importants, car il peut être contrôlé dans le temps et rapidement induite. Lorsque les neurones qui expriment ChR2 sont exposés à bleu clair (470 nm) ont rapidement dépolariser et présentent des taux élevés de tir 3-5. Une telle activation ciblée des neurones spécifiques chez les animaux se déplaçant librement a révélé le caractère suffisant des neurones particuliers pour des comportements tels que le CO 2 d'évitement 3, trompe l'extension 2,4, et le géant en fibre de réactions effarouchées médiation 4. Cependant, les sources intenses de lumière nécessaires pour stimuler ChR2 également stimuler les photorécepteurs, en appliquant optogenetic techniques du système visuel a été limité. En combinant une approche optogenetic avec une mutation qui altère phototransduction, nous avons démontré que l'activation d'un ensemble spécifique de neurones du lobe optique de la mouche peut conduire le comportement de fuite utilisé pour éviter la collision 6.
La plupart, sinon la totalité, des animaux visuels présentent un comportement de fuite pour éviter les collisions avec des objets venant en sens inverse. La marche ou arrêt mouches, lorsqu'ils sont présentés avec une collision imminente, le décollage en vol, loin de la collision venant en sens inverse 7-9. Ces décollages sont caractérisés par des ailes soulevées avant le décollage et une trajectoire de vol instable 10,11. Cette réponse est distinct du géant en fibre de réaction de sursaut médiation, sauts qui ne sont pas précédés par des ailes soulevées, et le plus souvent se traduire par une chute en chute libre 4,9. Après avoir identifié un ensemble spécifique de neurones sensibles métier dans le lobe optique, Foma-1 neurones, qui sont uniquely accordé à coder des objets approchant, nous avons cherché à sonder leur implication dans le comportement de la mouche métier évasion. Ici, nous démontrons l'utilisation de optogénétique pour activer sélectivement les neurones et susciter des comportements d'évasion de la mouche.
Nous utilisons le système de Gal4-UAS activateur transcriptionnel pour diriger l'expression de ChR2 dans les Foma-1 neurones. ChR2 nécessite le cofacteur tout-trans-rétinal et comme cela se trouve dans des niveaux faibles dans le système nerveux central chez la drosophile elle doit être complétée dans le régime alimentaire des mouches. 3,4 Comme la lumière vive est utilisée pour activer ChR2 et les mouches des comportements phototactiques forts 12, nous avons cherché à éliminer la possibilité d'une réponse visuelle au stimulus. Pour ce faire, nous avons utilisé les animaux qui étaient mutant homozygote pour un allèle nul du gène NORPA, qui code pour une composante essentielle de la cascade de phototransduction, la phospholipase C-β. Photorécepteurs de ces mouches mutantes sont incapables de responsabilitéd à la lumière 13. Pour tester la stimulation de la réponse optogenetic évasion, nous avons besoin d'isoler une seule mouche et se baigner dans la lumière bleue brillante. Pour ce faire, nous plaçons les mouches individuelles dans les embouts de pipettes. Un embout de la pipette est placé dans un support personnalisé, tel que la mouche geotactically marcher sur la pointe et sur une plate-forme rectangulaire. La mouche est capable de se promener librement autour de la partie supérieure de cette plate-forme. La plate-forme est entourée de quatre rangées de LED bleues, chacune contenant 3 LED, axés sur le dessus de la plate-forme. Après la mouche est sur la plate-forme, les LED sont allumées, et la réponse de la mouche est enregistrée à l'aide d'une caméra grande vitesse 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons démontré une stimulation optogenetic des comportements de fuite en se baignant librement marcher mouches dans la lumière bleue brillante. Cette approche peut être facilement adaptée à examiner les comportements des autres mouches librement à pied, et peut être adapté aux grandes plates-formes par un simple carrelage des réseaux de DEL, nous avons utilisé sur une grande surface. En utilisant soit la caméra bon marché, nous décrivons, ou d'autres systèmes de caméras disponibles, l'…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par une bourse de Dean Stanford (SEJdV), un National Institutes of Pioneer Award directeur de la santé (TRC DP0035350), le Prix de la Fondation McKnight Scholar de (TRC) et R01 EY022638 (TRC).
Materials
| Reagent | |||
| All-trans Retinal | Advance Scientific & Chemical Inc | R3041 | |
| Equipment | |||
| Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼” ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼” NPT Male |
| Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 |
References
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