Bir Stereotaktik Enjeksiyon MicroRNA-ifade Fare Hippocampus CA1 Bölgesi Lentiviruses ve Davranış Sonuç Değerlendirilmesi
Summary
MicroRNA beyin yapısı ve fonksiyonu önemli rolleri vardır. Burada aşırı ifadesi bir mühendislik miRNA-ifade lentivirüs stereotaktik enjeksiyonu kullanılarak hipokampal miRNA uygulamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, değerlendirmek için nispeten hızlı bir yöntem olarak hizmet verebilir<em> In vivo</em> Spesifik beyin bölgelerinde aşırı ifade miRNAs etkisi.
Abstract
MicroRNA (miRNA'lar) uzun 22 nükleotid çevresinde küçük düzenleyici tek zincirli RNA molekülleri olduğunu olabilir her hedef çok sayıda mRNA transkript ve neden olan yıkım ve / veya bu hedeflere inhibe çeviri tarafından loş bütün bir gen yolu. Çeşitli miRNA'lar nöronal yapı ve fonksiyonu sürdürmek ve üst düzey beyin fonksiyonlarında önemli rol oynayan ve yöntemleri bu işlevler keşfetmek için kendi seviyelerini değiştirmek için aranır. Burada, MiRNA kodlayan virüs partiküllerinin stereotaktik enjeksiyon yoluyla uygulanan farelerde aşırı miRNAs bilişsel sonuçları incelemek için in vivo metot, doğrudan mevcut. Özellikle, mevcut protokol memeli bellek konsolidasyon, öğrenme ve stres yanıtları katkıda bulunur ve uygun bir enjeksiyon yeri sunmaktadır hipokampal CA1 bölgesinde, içine enjeksiyon içerir. Koordinatları fare bregma ve virüs perfüzyon dijital kontrollü ve çok yavaş tutulur göre ölçülür.Enjeksiyon sonrası, cerrahi yara kapalı ve hayvanların kurtarmak olduğunu. Ilgili mRNA hedeflerin susturucular kodlama lentivirüsler naif fare ile, gözlenen etkisi sorumlu özel miRNA / hedef etkileşimi ima hizmet, tuzlu ve kontrol grubu olarak "boş" lentivirüs vektörleri enjekte fareler enjekte fareler. Bir ay sonrası enjeksiyon, hayvanlar kendi navigasyon öğrenme ve bellek yeteneklerini değerlendirmek için Morris Su Maze (MWM) incelenmiştir. MWM 1 cm su yüzeyinin altında batık küçük bir platformu ile renkli su dolu yuvarlak bir tank. Tankın etrafında sabit görsel ipuçları mekansal navigasyon (ses ve dünyanın manyetik alanı da navigasyon hayvanlar yardımcı olabilir) için izin verir. Video kamera izleme bulmak ve platform miktar için yüzme ve zaman yol ölçüm sağlar. Fare ilk gizli montaj platformu zorla yüzme bir kaçış sunuyor öğretilir, daha sonra bu kaçış ve f kullanmak için test edilirinally, platform kaldırılır ve fare önceki konumuna hatırlar eğer prob testleri incelemektir. Birkaç gün üst üste tekrar tekrar test platformu bulmak ve monte etmek daha kısa gecikmeleri test farelerin gelişmiş performans vurgulamak ve daha direkt hatları platform ya da konumu ulaşmak için. Bu gelişme daha sonra (yükseltilmiş artı labirent gibi) özel olarak test edilebilir bozulmuş öğrenme ve bellek ve / veya anksiyete, temsil göstermek için başarısız. Bu yaklaşım, bilişsel eğitim ve / veya stres ile ilgili işlemlerde özel miRNAs ve hedef transkript doğrulama sağlar.
Introduction
Sinir sisteminin işleyişinde özellikle miRNA'lar rolü son zamanlarda birçok çalışmada lentiviral enjeksiyon meydan olmuştur. MiRNA sinaps yapısı 1, sinaptogenez 2 ve sinaps yeniden ve bakım 3 bakımı ve yeniden şekillendirme için çok önemli olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmalar güçlü bir yukarı şekillendirme hem de sinir sistemi, bilişsel fonksiyon ana çıkış korunmasında çok katmanlı düzenleyici etkileri ile, miRNA'lar meşgul olduğunu göstermektedir. Kemirgen beynindeki belirli bölgeleri lentivirüs parçacıkların stereotaktik enjeksiyon sinaps morfolojisi ve nöronal aktivite Değişiklik için arama sağlar ve 4,5-aşırı ifade transkript fonksiyonel önemi kurulması için kullanılmıştır. MiRNA-ifade lentivirüsler ile iyi tanımlanmış beyin alanlarda nöronların doğrudan enfeksiyon yaşlanma, beyin hastalıkları ve nörodejenerasyon çalışmalarında karışmış olabilir; miRNA Çalışmalarıs davranışsal düzenleme 6-8 dünyasında bir çok daha az gelişmiş devlet altındadır, ve stereotaktik enjeksiyon miRNA-ifade davranış testleri takip lentivirüs parçacıklar gibi amaçlar için yararlı olabilir. Aşırı ya da az ifade uyaran için çok daha zahmetli yöntemi genetik knock-in veya farelerde mühendislik içerir. Genetik sistemleri daha da ifade koşullu ve zamansal kontrolünün (örneğin, Kre-Lox, Tet sistemler) için izin verebilir, ancak bu pek bir enjeksiyon işlemi uzamsal özgüllüğünü sunmak ve sızdırma bir miktar hemen hemen her zaman bulunmamaktadır. Ayrıca, mühendislik yöntemleri ameliyat gerektirmeyen ve nispeten iyi tekrarlanabilirlik ile laboratuvarlar arasında kullanılabilir, ancak onlar daha yavaş ve çok daha fazla insan gücü ve mali kaynak gerektirir. Buna ek olarak, kontrol geçici aşırı ya da enjekte edilmiş farelerde altında ekspresyonu genetik farelere kıyasla çok daha doğru olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir lentivirüs stereotaktik enjeksiyon için hem yukarı veya farklı genler ve miRNA'lar yük atma in vivo değerlendirme için nispeten hızlı bir yöntemdir. Başlıca alternatif daha sonra çok daha zahmetli ve zaman alan bir tekniktir lentivirüs doğrudan enjeksiyon, bir genetik faredir. Buna ek olarak, yukarı regülasyonu, lentivirüs enjeksiyon, yetişkin fare belirli bir zamanda meydana gelir ve çoğu zaman geçici denetimi genetiği farelerde olduğu gibi, geliştirme sırasında sızdırma ol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Beyin Bilimleri Edmond ve Lily Safra Merkezi (SB dostluk), İsrail Bilim Vakfı (HS Hibe No 378/11,) The Legacy Mirası Biyomedikal Bilim Ortaklık Programı ve Bilimsel için Alman İsrail Vakfı tarafından desteklenmiştir Araştırma ve Geliştirme (GIF) (HS Grant No 1093-32.2/2010,).
Materials
| Equipment | |||
| Rodent weigh scale | Burtons (UK) | 115-455 | |
| heating pad | FIRstTechnology | DCT-25 | |
| trimming machine | Stoelting | 51465 | |
| stereotact | Stoelting | 51730 | |
| Scalpel and blades | Kent scientific | INS500348 | |
| Harland syringe | Hamilton | 7632-01 | |
| driller | Stoelting | 51449 | |
| digital pump | Harvard apparatus | 704507 | |
| Water tank and platform | Stoelting | 60135 |
| Reagents | |||
| ketamine | Vetoquinol(Lure France) | 3055503 | |
| domitor | Orion pharma | 107140-10 | |
| Rimadyl | Pfizer animal health | 24751 | |
| moisture ointment – Synthomycine 5% | Rekah Pharmaceutical | 195 | |
| histoacryl | Braun | 112101 | |
| saline | Sigma Aldrich | D8662 |
References
- Siegel, G., et al. A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis. Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).
- Jin, P., et al. Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway. Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).
- Simon, D. J. The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions. Cell. 133, 903-915 (2008).
- Consiglio, A. In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice. Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).
- Jakobsson, J., Lundberg, C. Lentiviral vectors for use in the central nervous system. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).
- Berson, A. Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer’s disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice. EMBO Molecular Medicine. , (2012).
- Haramati, S. MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).
- Shaltiel, G., et al. Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target. Brain Structure & Function. , 10-1007 (2012).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).
- Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs & transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).
- Nunez, J. Morris Water Maze Experiment. J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).
- Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer’s disease model mice. J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).
- Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. Genetic approach for intracerebroventricular delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).
