Injeção estereotáxica de microRNA-expressando Lentiviruses ao mouse Região CA1 do hipocampo e avaliação do resultado Behavioral
Summary
MicroRNAs têm papéis importantes na estrutura e função cerebral. Aqui nós descrevemos um método para impor miRNA hipocampo sobre-expressão usando a injeção estereotáxica de um lentivírus miRNA-expressando engenharia. Esta abordagem pode servir como um modo relativamente rápido para avaliar a<em> In vivo</em> Efeitos de miRNAs sobre-expressos em regiões específicas do cérebro.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) são moléculas de RNA de fita simples reguladoras pequenas cerca de 22 nucleotídeos de comprimento que podem cada alvo numerosas transcrições de mRNA e dim todo um gene de expressão da via pela destruição indução e / ou inibindo a tradução destes objectivos. Vários miRNAs desempenham papéis fundamentais na manutenção da estrutura e função neuronal e nas funções cerebrais de nível superior, e os métodos são procurados para manipular os seus níveis para explorar essas funções. Aqui, apresentamos uma relação direta método in vivo para examinar as consequências cognitivas de miRNAs aplicadas em excesso em ratos por injeção estereotáxica de partículas virais miRNA-codificação. Especificamente, o protocolo atual envolve a injeção na região CA1 do hipocampo, que contribui para a consolidação de mamíferos memória, aprendizagem, e as respostas ao estresse, e oferece um local de injeção conveniente. As coordenadas são medidas de acordo com a bregma rato e perfusão vírus é controlado digitalmente e mantido muito lento.Após a injecção, a ferida é selada a cirurgia e os animais recuperar. Lentivírus codificação silenciadores dos alvos de RNAm correspondentes servem para envolver a interação miRNA / target específico responsável pelo efeito observado, com camundongos normais, os camundongos injetados com solução salina e camundongos injetados com vetores lentivírus "vazios" como controles. Um mês após a injeção, os animais são examinados no labirinto aquático de Morris (MWM) para avaliar a sua aprendizagem de navegação e capacidades de memória. A MWM é um tanque redondo preenchido com água colorida com uma pequena plataforma submersa um centímetro abaixo da superfície da água. Estímulos visuais constantes ao redor do tanque permitem navegação espacial (som e do campo magnético da Terra pode também ajudar os animais a navegar). Monitoramento de câmeras de vídeo permite medir a rota de mergulho e o tempo para encontrar e atingir a plataforma. O mouse é ensinado pela primeira vez que a montagem da plataforma escondida oferece uma fuga da natação forçada, que é então testado para a utilização deste fuga e finalmente, a plataforma é removida e testes com sondas de examinar se o rato lembra sua localização anterior. Testes repetidos ao longo de vários dias consecutivos destacar melhorou o desempenho de ratinhos testados em menores latências para encontrar e montar a plataforma, e as vias mais directos como para alcançar a plataforma ou a sua localização. Fracasso para mostrar essa melhoria representa aprendizagem e memória prejudicada e / ou ansiedade, que pode então ser testada especificamente (por exemplo, no labirinto em cruz elevado). Esta abordagem permite a validação dos miRNAs específicos e transcrições alvo nos processos relacionados ao estresse cognitivo e / ou estudado.
Introduction
O papel dos miRNAs particulares em funcionamento do sistema nervoso foi recentemente desafiado por injeção lentiviral em vários estudos. MiRNAs foram encontrados para ser crucial para a manutenção e re-moldar uma estrutura sinapse, sinaptogênese 2 e remodelação sinapse e manutenção 3. Estes estudos sugerem fortemente que miRNAs estão envolvidos, através de efeitos de regulação de vários níveis, tanto na formação e na manutenção da saída principal do sistema nervoso, a função cognitiva. Injeção estereotáxica de partículas lentivírus em regiões específicas no cérebro de roedores permite à procura de alterações na morfologia sinapse e atividade neuronal, e foi usado para estabelecer o significado funcional de transcritos sobre-expressos 4,5. Infecção direta de neurônios em áreas do cérebro bem definidas com miRNA-expressando lentivírus podem estar envolvidos em estudos de envelhecimento, distúrbios cerebrais e neurodegeneração; Estudos de miRNAs no campo da regulação comportamental 6-8 estão em um estado muito menos avançada, e injeção estereotáxica de miRNA-expressando partículas lentivírus seguidos por testes comportamentais podem ser úteis para tais fins. Um método muito mais trabalhoso para induzir sobre ou sub-expressão envolve a engenharia genética knock-in ou camundongos knockout. Sistemas genéticos podem ainda permitir o controlo condicional e temporal sobre a expressão (por exemplo, Cre-Lox, sistemas Tet), mas estes dificilmente oferecem a especificidade espacial do procedimento de injecção e existe quase sempre uma certa quantidade de fugas. Além disso, os procedimentos de engenharia não necessitam de cirurgia e pode ser usado em laboratórios com relativamente boa reprodutibilidade, no entanto, são lentos e exigem muito mais recursos humanos e financeiros. Além disso, o controlo temporal da sub-expressão em ratinhos injectados sobre ou é muito mais preciso em comparação com ratinhos geneticamente modificados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Injeção estereotáxica de um lentivírus é um método relativamente rápido para a avaliação in vivo, tanto para down-regulação de diferentes genes e miRNAs cima ou. A principal alternativa é um rato geneticamente modificado que é uma técnica consome muito mais trabalhoso e demorado, em seguida, a injeção direta lentivírus. Além disso, a regulação para cima, na injecção de lentivírus, ocorre a um tempo específico no ratinho adulto e não inclui qualquer possibilidade de permeabilidade durant…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudo foi apoiado pelo Edmond e Lily Safra Center for Brain Sciences (SB comunhão), The Legacy Heritage Ciências Biomédicas Programa de Parceria da Fundação Israel Science (Grant No. 378/11, a HS) e da Fundação Alemã de Israel for Scientific Pesquisa e Desenvolvimento (GIF) (Grant No. 1093-32.2/2010, a HS).
Materials
| Equipment | |||
| Rodent weigh scale | Burtons (UK) | 115-455 | |
| heating pad | FIRstTechnology | DCT-25 | |
| trimming machine | Stoelting | 51465 | |
| stereotact | Stoelting | 51730 | |
| Scalpel and blades | Kent scientific | INS500348 | |
| Harland syringe | Hamilton | 7632-01 | |
| driller | Stoelting | 51449 | |
| digital pump | Harvard apparatus | 704507 | |
| Water tank and platform | Stoelting | 60135 |
| Reagents | |||
| ketamine | Vetoquinol(Lure France) | 3055503 | |
| domitor | Orion pharma | 107140-10 | |
| Rimadyl | Pfizer animal health | 24751 | |
| moisture ointment – Synthomycine 5% | Rekah Pharmaceutical | 195 | |
| histoacryl | Braun | 112101 | |
| saline | Sigma Aldrich | D8662 |
References
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