Preparação do antigénio tumoral-carregados células dendríticas maduras para a imunoterapia
Summary
O método mais vulgarmente usado para a geração de grandes números de células dendríticas autólogas (DCs), para uso na imunoterapia de tumores é descrita. O método utiliza a IL-4 e GM-CSF a partir de monócitos diferenciam DCs. As DC imaturas são estimuladas a maduro e, em seguida, carregado com os antigénios, antes de serem injectadas de novo no paciente.
Abstract
Embora estudos clínicos têm demonstrado que as vacinas DC antígeno-carregados são seguros e promissora terapia para tumores 1, sua eficácia clínica ainda não foi estabelecida. O método descrito abaixo, preparadas de acordo com as Boas Processo de Fabricação (GMP), é uma otimização do método de preparação ex vivo mais comum para a geração de um grande número de DCs para estudos clínicos 2.
Nosso método utiliza o TLR sintético 3 agonista Carboxymethylcellulose ácido poli-L-lisina Polyinosinic-Polycytidylic (Poly-ICLC) para estimular os DCs. O nosso estudo anterior estabeleceu que a poli-ICLC é o estímulo da maturação individual mais potente para DCs humanas, tal como avaliado por uma sobre-regulação de CD83 e CD86, a indução da interleucina-12 (IL-12), factor de necrose tumoral (TNF), o interferão-gama induzido proteína 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), e os interferões tipo I (IFN), e interleucina mínima 10 (IL-10) de produção. </p>
DCs são diferenciados a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC congelados), obtidos por leucaferese. As PBMC são isoladas por centrifugação em gradiente de Ficoll e congelado em alíquotas. No dia 1, as CMSPs são descongelados e semeados em frascos de cultura de tecido para seleccionar os monócitos que aderiram à superfície plástica após 1-2 horas de incubação a 37 ° C na incubadora de cultura de tecido. Após a incubação, os linfócitos são lavados e os monócitos aderentes foram cultivadas durante 5 dias na presença de interleucina-4 (IL-4) e de granulócitos factor de estimulação de colónias de macrófagos (GM-CSF) para se diferenciarem para DCs imaturas. No dia 6, DCs imaturas são pulsadas com a proteína hemocianina de lapa buraco de fechadura (KLH), que serve como um controlo para a qualidade da vacina e pode aumentar-se a imunogenicidade da vacina contra a 3. As DCs são estimuladas a amadurecer, carregado com antígenos peptídeos, e incubadas durante a noite. No dia 7, as células são lavadas, e congelado em alíquotas de 1 ml contendo4-20 x 10 6 células, utilizando um congelador de taxa controlada. Testes de liberação de lote para os lotes de DCs é realizada e deve atender a especificações mínimas, antes de serem injetadas em pacientes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fase I e II de ensaios clínicos de DCs derivadas de monócitos têm mostrado que induzem respostas imunitárias em pacientes, no entanto o sucesso clínico tem sido limitada 1. Isto pode ser em parte devido à falta de consenso sobre a forma de gerar os DCs óptimas para a utilização de imunoterapia tumoral. Embora haja várias maneiras de gerar DCs clínico grau, estes métodos variam em termos do uso de citocinas utilizadas para diferenciar os monócitos, os estímulos utilizados para induzir a maturaç?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer Andres Salazar (Oncovir, Inc.) para o dom do Poly-ICLC.
Materials
| Reagent/Supplies/Equipment | Manufacturer | Catalog No. | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M HEPES buffered saline | BioWhittaker | 17-737E | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | BioWhittaker | 17-516F | |
| Human albumin, 25% solution USP | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Sterile saline USP | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml | Berlex | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml | Oncovir | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 sq cm EasyFlasks | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon 6-well tissue culture plates | Becton Dickinson | 353046 | |
| 1.8 ml CryoTube vials | Nalgene Nunc | 377267 | |
| Controlled Rate Freezer | Thermo | CryoMed |
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