הכנת תאים דנדריטים גידול Antigen טעון בוגרים לחיסוניים
Summary
השיטה הנפוצה ביותר להפקת כמויות גדולות של תאים דנדריטים אוטולוגי (DCS) לשימוש באימונותרפיה גידול מתוארת. השיטה משתמשת IL-4 ו-GM-CSF להבדיל מDCs מונוציטים. את DCs הבוסר הוא גירוי לבוגרת ולאחר מכן נטען עם אנטיגנים לפני שהם מוזרקים חזרה לחולה.
Abstract
בעוד שמחקרים קליניים הוכיחו שהחיסונים DC אנטיגן טעונים בטוחים ומבטיחים לטיפול בגידולים 1, היעילות הקלינית שלהם עדיין לא הוקמה. השיטה המתוארת להלן, ערוכה בהתאם לתהליך ייצור טוב (GMP) הנחיות, היא אופטימיזציה של שיטת הכנת vivo לשעבר הנפוצה ביותר ליצירת מספר רב של מחקרים קליניים לDCs 2.
השיטה שלנו מנצלת את TLR הסינטטי 3 אגוניסט carboxymethylcellulose חומצה פולי-L-ליזין Polyinosinic-Polycytidylic (פולי-ICLC) כדי לעורר את DCS. המחקר הקודם שלנו הוקם שפולי-ICLC הוא גירוי התבגרות הפרט החזק ביותר לDCs אדם כפי שהוערך על ידי גברת ביטוי של CD83 וCD86, אינדוקציה של interleukin-12 (IL-12), גורם נמק גידול (TNF), אינטרפרון גאמא-Induced חלבון 10 (IP-10), 1 interleukmin (IL-1), וסוג שהאינטרפרונים (IFN), והמינימאלי אינטרלוקין 10 (IL-10) ייצור. </p>
DCs הם מובחנים מתאי קפואים דם היקפי (mononuclear PBMCs) המתקבלים על ידי leukapheresis. PBMCs מבודד על ידי צנטריפוגה שיפוע Ficoll וקפוא בaliquots. ביום 1, PBMCs הם הפשירו ומצופה על צלוחיות תרבית רקמה כדי לבחור למונוציטים שנצמדים למשטחי הפלסטיק לאחר דגירה 1-2 שעות על 37 מעלות צלזיוס בתרבית רקמת החממה. לאחר דגירה, הלימפוציטים הם לשטוף ומונוציטים חסיד בתרבית במשך 5 ימים בנוכחות של interleukin-4 (IL-4) וגורם מגרה מקרופאג'ים מושבה granulocyte (GM-CSF) כדי לבדל לDCs בשלה. ביום 6, DCS בשלה הם פעמו עם חלבון hemocyanin עלוקת חור המנעול (KLH) המשמש כבקרה לאיכות של החיסון ועלולים להגביר את התגובה החיסונית של החיסון 3. את DCs מומרצים להבשיל, עמוס אנטיגנים פפטיד, וטופחו במשך הלילה. ביום 7, התאים נשטפים, וקפוא ב1 aliquots מ"ל המכיל4 – 20 x 10 6 תאים באמצעות מקפיא מבוקר שיעור. בדיקות שחרורו הרבה לקבוצות של DCs מבוצעת וחייבות לעמוד במפרט מינימאליים לפני שהם מוזרקים לחולים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלב I ו-II של ניסויים קליניים DCs מונוציטים הנגזרות הראו כי הם לעורר תגובות חיסוניות בחולים עם זאת הצלחה קלינית הייתה מוגבלת 1. זה עשוי להיות בחלקו בשל חוסר הסכמה על איך ליצור את DCs האופטימלי לשימוש immunotherapeutic גידול. אמנם יש דרכים רבות כדי ליצור DCs הקליני בדרגה, בשיטו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לאנדרס סלזר (Oncovir, Inc) על המתנה של פולי-ICLC.
Materials
| Reagent/Supplies/Equipment | Manufacturer | Catalog No. | |
| RPMI-1640 medium with L-glutamine | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M HEPES buffered saline | BioWhittaker | 17-737E | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | BioWhittaker | 17-516F | |
| Human albumin, 25% solution USP | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Human AB serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Sterile saline USP | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml | Berlex | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml | Oncovir | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 sq cm EasyFlasks | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon 6-well tissue culture plates | Becton Dickinson | 353046 | |
| 1.8 ml CryoTube vials | Nalgene Nunc | 377267 | |
| Controlled Rate Freezer | Thermo | CryoMed |
References
- Lesterhuis, W. J., et al. Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).
- Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2, 37-56 (2010).
- Schumacher, K. Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate vaccines as novel therapeutic tools in malignant disorders. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 127, 1-2 (2001).
- Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
- Eichler, H., et al. Multicenter study on in vitro characterization of dendritic cells. Cytotherapy. 10, 21-29 (2008).
- Feuerstein, B., et al. A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature dendritic cells ready for clinical use. J. Immunol. Methods. 245, 15-29 (2000).
- O’Neill, D., Bhardwaj, N. Generation of autologous peptide- and protein-pulsed dendritic cells for patient-specific immunotherapy. Methods Mol. Med. 109, 97-112 (2005).
- de Vries, I. J., et al. Phenotypical and functional characterization of clinical grade dendritic cells. J. Immunother. 25, 429-438 (2002).
- Jonuleit, H., et al. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142 (1997).
- Lee, A. W., et al. A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy. Vaccine. 20, A8-A22 (2002).
- Bhardwaj, N. Harnessing the immune system to treat cancer. J. Clin. Invest. 117, 1130-1136 (2007).
- Gnjatic, S., Sawhney, N. B., Bhardwaj, N. Toll-like receptor agonists: are they good adjuvants?. Cancer J. 16, 382-391 (2010).
- Kedl, R. M., Kappler, J. W., Marrack, P. Epitope dominance, competition and T cell affinity maturation. Curr. Opin. Immunol. 15, 120-127 (2003).
- Bogunovic, D., et al. TLR4 engagement during TLR3-induced proinflammatory signaling in dendritic cells promotes IL-10-mediated suppression of antitumor immunity. Cancer Research. 71, 5467-5476 (2011).
- Verdijk, R. M., et al. Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly(I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells. J. Immunol. 163, 57-61 (1999).
- Rouas, R., et al. Poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive IL-12. Int. Immunol. 16, 767-773 (2004).
- Jongmans, W., Tiemessen, D. M., van Vlodrop, I. J., Mulders, P. F., Oosterwijk, E. Th1-polarizing capacity of clinical-grade dendritic cells is triggered by Ribomunyl but is compromised by PGE2: the importance of maturation cocktails. J. Immunother. 28, 480-487 (2005).
- Krause, P., et al. Prostaglandin E2 is a key factor for monocyte-derived dendritic cell maturation: enhanced T cell stimulatory capacity despite IDO. J. Leukoc. Biol. 82, 1106-1114 (2007).
- Morelli, A. E., Thomson, A. W. Dendritic cells under the spell of prostaglandins. Trends Immunol. 24, 108-111 (2003).
- Adams, M., et al. Dendritic cell (DC) based therapy for cervical cancer: use of DC pulsed with tumour lysate and matured with a novel synthetic clinically non-toxic double stranded RNA analogue poly [I]:poly [C(12)U] (Ampligen R). Vaccine. 21 (12), 787-790 (2003).
- Colombo, M. P., Trinchieri, G. Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev. 13, 155-168 (2002).
- Mayordomo, J. I., et al. Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nat Med. 1, 1297-1302 (1995).
- Dhodapkar, M. V., et al. Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells. J. Clin. Invest. 104, 173-180 (1999).
- Schuler-Thurner, B., et al. Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived dendritic cells. J. Exp. Med. 195, 1279-1288 (2002).
