Summary

ניתוח של הנגישות המרככת של שאריות ציסטאין על<em> תירס rayado Fino וירוס</em> חלקיקי נגיף דמויים מיוצרים ב<em> Nicotiana benthamiana</em> צמחים וקישור צולב של פפטידים לVLPs

Published: February 14, 2013
doi:

Summary

שיטה לנתח את נגישות הממס של קבוצת thiol של שאריות ציסטאין של<em> תירס rayado Fino וירוס</em> (MRFV) חלקיקי וירוס דמוי (VLPs) ואחריו תגובה של פפטיד צלב-linking מתוארים. השיטה מנצלת את הזמינות של מספר קבוצות כימיות על פני השטח של VLPs שיכול להיות מטרה לתגובות ספציפיות.

Abstract

חיקוי וניצול מאפייני נגיף ומאפייני physicochemical ופיסיים טומן בחובו הבטחה לספק פתרונות לכמה מהאתגרים הקשים ביותר בעולם. המגוון והסוגים של וירוסים יחד עם המאפיינים המסקרנים הצרופים פוטנציאלי לתת אינספור הזדמנויות ליישומים בטכנולוגיות וירוס מבוססים. וירוסים יש את היכולת עצמית להרכיב לתוך חלקיקים בעלי צורה דיסקרטית וגודל, סגולי של סימטריה, polyvalence, ומאפיינים יציבים תחת מגוון רחב של תנאי טמפרטורה וחומציות. שלא במפתיע, עם מגוון עשיר כל כך של תכונות, וירוסים מוצעים לשימוש בחומרים ביולוגיים 9, חיסונים 14, 15, חומרים אלקטרוניים, כלים כימיים, ו11 מיכלים מולקולריים אלקטרוניים 4, 5, 10, 16, 18, ​​12.

על מנת לנצל וירוסים בננוטכנולוגיה, הם חייבים להיות שונים מהצורות הטבעיות שלהם כדי להקנות פונקציות חדשות. זה יחסי ציבור מאתגריםocess יכול להתבצע באמצעות מספר מנגנונים כולל הנדסה גנטית של הגנום הנגיפי וכימיות הצמדת מולקולות זרות או רצויות לקבוצות תגובתי חלקיקי וירוס 8. היכולת לשנות וירוס בעיקר תלויה במאפייני physiochemical ופיסיים של הנגיף. בנוסף, שינויים הגנטיים או physiochemical צריכות להתבצע מבלי להשפיע על המבנה ותפקוד יליד וירוס וירוס לרעה. (MRFV) חלבוני מעייל rayado תירס Fino וירוס עצמי להרכיב בחיידקי Escherichia ייצור VLPs היציב וריק שהם התייצבו על ידי בין חלבונים אינטראקציות ושניתן להשתמש ביישומים מבוססי טכנולוגיות וירוס 8. VLPs מיוצר בצמחי טבק נבדק כפיגום עליו מגוון של פפטידים ניתן להציג 13 קוולנטית. כאן, אנו מתארים את השלבים ל1) תקבעו מי מcysteines ממס הנגיש בcapsid וירוס זמין לmodifiקטיון, ו2) Bioconjugate פפטידים לcapsids השונה. באמצעות שאריות דובר או mutationally הוכנסו-חומצת אמינו וטכנולוגיות צימוד סטנדרטיות, במגוון רחב של חומרים שמוצגים על פני השטח של וירוסי צמחים כגון, וירוס Brome פסיפס 3, וירוס mottle ציפורנים 12, Cowpea chlorotic mottle 6 וירוס, פסיפס טבק וירוס 17, וירוס לפת צהוב פסיפס 1, וMRFV 13.

Protocol

1. הרכבת חיסון נגיף וטיהור VLPs מצמחי Nicotiana benthamiana לייצר תעתיקי תרי T7-RNA מתפו"א וירוס X (PVX)-מבוססי פלסמידים וקטור שנשאו MRFV חלבון Cys מוטצית מעייל (CP) גנים 12, באמצעותו של Ambion T7-mMessage mMachine הקיט פראי מסוג (wt) ו. <…

Representative Results

ביטוי זמני של גני חלבוני מוטצית MRFV מעייל (CP) בנ צמחי benthamiana בVLPs ייצור הווקטור PVX מבוסס מתוארים באיור 1. גן חלבון מעייל MRFV modified מוגבר באמצעות PCR ולאחר מכן תחת שליטת התעתיק של אמרגן CP subgenomic המשוכפל בוקטור PVX מבוסס, pP2C2S 2, (מתנה של ד Baulcombe, מעבדות סיינס?…

Discussion

השיטה שהוצגה כאן מאפשרת ניתוח מאוד רגיש ומהיר של cysteines הווה על פני השטח של VLPs בצמחים המיוצרים כמו גם במערכות חלבון אחרות תגובתי. Maleimides הם ריאגנטים thiol ספציפיים, אשר מגיבים עם מולקולות חופשיות sulfhydryl המכילים ליצור קשרי thioether יציבים. שיטה זו נשענת על הספציפיות של maleimides לה…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Materials

Name of the reagent Company Catalog number Comments
Thinwall, Ultra-Clear Tubes Beckman 344059  
mMESSAGE mMACHINE T7 Kit Life Tecnologies AM1344M  
Fluorescein-5-Maleimide Thermo Scientific Life Technologies 46130 F150 46130 is out of order substitute with F150
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific 28005  
EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format Thermo Scientific 21901  
SM(PEG)n Crosslinkers Thermo Scientific 22107  
10-20% Tris-Glycine gel Invitrogen EC61352  
Laemmli Buffer Bio-Rad 1610737  
Tris Glycine SDS Running Buffer Invitrogen LC2675  
Tris Glycine Transfer Buffer Invitrogen LC3675  
Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich Invitrogen LC2001  
Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG Kirkegaard and Perry Laboratories 0751516  
NBT/BCIP Phosphatase Substrate Kirkegaard and Perry Laboratories 508107  

References

  1. Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle. Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).
  2. Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J. 2, 549-557 (1992).
  3. Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. Packaging of gold particles in viral capsids. J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).
  4. Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles. Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).
  5. Gazit, E. Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires. FEBS. J. 274, 317-322 (2007).
  6. Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation. Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).
  7. Hammond, R. W., Hammond, J. Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli. Virus Res. 147, 208-215 (2010).
  8. Hermamson, G. T. . Bioconjugate techniques. , (1991).
  9. Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo. Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).
  10. Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires. Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).
  11. Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate. J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).
  12. Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus. Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).
  13. Natilla, A., Hammond, R. W. Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display. J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).
  14. Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route. Virology. 343, 2224-2235 (2005).
  15. Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus. Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).
  16. Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus. J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).
  17. Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
  18. Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology. Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).

Play Video

Cite This Article
Natilla, A., Hammond, R. W. Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs. J. Vis. Exp. (72), e50084, doi:10.3791/50084 (2013).

View Video