Analyse van de Solvent Toegankelijkheid van cysteïneresten op<em> Maïs rayado fino virus</em> Virus-achtige deeltjes, geproduceerd in<em> Nicotiana benthamiana</em> Plants and Cross-linking van peptiden aan VLP
Summary
Werkwijze voor het oplosmiddel toegankelijkheid van de thiolgroep van cysteine residuen van analyseren<em> Maïs rayado fino virus</em> (MRFV)-virus-achtige deeltjes (VLP's) gevolgd door een peptide vernettingsreactie beschreven. De methode maakt gebruik van de beschikbaarheid van verschillende chemische groepen op het oppervlak van de VLP's die het doelwit zijn van specifieke reacties.
Abstract
Het nabootsen van en het benutten van virus eigenschappen en fysisch-chemische en fysische eigenschappen houdt belofte om oplossingen te bieden om een aantal van de meest urgente in de wereld uitdagingen. De enorme bereik en de soorten virussen gekoppeld aan hun intrigerende eigenschappen potentieel geven eindeloze mogelijkheden voor toepassingen in virus-gebaseerde technologieën. Virussen hebben de mogelijkheid om zelf te monteren in deeltjes met discrete vorm en grootte specificiteit van symmetrie, veelzijdigheid en stabiele eigenschappen onder een breed temperatuurbereik en pH-omstandigheden. Niet verrassend, met zo'n opmerkelijke scala van eigenschappen, zijn virussen voorgesteld voor gebruik in biomaterialen 9, vaccins 14, 15, elektronische materialen, chemische middelen, en moleculaire elektronische containers 4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
Om virussen in nanotechnologie gebruiken, moeten zij worden gewijzigd in hun natuurlijke vorm om nieuwe functies geven. Deze uitdagende process kan worden uitgevoerd via verschillende mechanismen waaronder genetische modificatie van het virale genoom en chemisch verbonden buitenlandse of gewenste moleculen voor het virusdeeltje reactieve groepen 8. De mogelijkheid om een virus te passen vooral afhangt van de fysisch-chemische en fysische eigenschappen van het virus. Bovendien de genetische of fysisch aanpassingen moeten worden uitgevoerd zonder dat de virus natieve structuur en functie virus. Maize rayado fino virus (MRFV) manteleiwitten zelf-assembleren in Escherichia coli produceren stal en lege VLP die gestabiliseerd door eiwit-eiwit interacties en die gebruikt kunnen worden in virus-gebaseerde technologieën toepassingen 8. VLP's geproduceerd in tabaksplanten onderzocht als een steiger waarop verschillende peptiden covalent worden weergegeven 13. Hier beschrijven we de stappen 1) bepalen welke van de oplosmiddel-toegankelijke cysteines in een viruscapside beschikbaar voor wijzikation en 2) Bioconjugate peptiden om de gewijzigde capsiden. Met natieve of mutationally ingestoken aminozuurresten en standaard koppeling technologieën hebben vele verschillende materialen zijn op het oppervlak van plantenvirussen zoals Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12 Cowpea chlorotic mottle virus 6, tabaksmozaïekvirus virus 17, Turnip geel mozaïek virus 1 en MRFV 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
De werkwijze die hier maakt een zeer gevoelige en snelle analyse van reactieve cysteïnen aanwezig op het oppervlak van VLP van plantaardige en op andere eiwitcomplexen. Maleïmiden zijn thiol-specifieke reagentia die reageren met vrije sulfhydryl-bevattende moleculen stabiele thioether bindingen. Deze methode is gebaseerd op de specificiteit van de maleïmides te reageren met sulfhydrylgroepen niet betrokken bij interacties met andere aminozuren. Behoud van de natieve structuur van de VLP erg belangrijk het gehele proc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Thinwall, Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344059 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Life Tecnologies | AM1344M | |
| Fluorescein-5-Maleimide | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 is out of order substitute with F150 |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM(PEG)n Crosslinkers | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20% Tris-Glycine gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG | Kirkegaard and Perry Laboratories | 0751516 | |
| NBT/BCIP Phosphatase Substrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 508107 |
References
- Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle. Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).
- Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J. 2, 549-557 (1992).
- Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. Packaging of gold particles in viral capsids. J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).
- Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles. Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).
- Gazit, E. Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires. FEBS. J. 274, 317-322 (2007).
- Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation. Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).
- Hammond, R. W., Hammond, J. Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli. Virus Res. 147, 208-215 (2010).
- Hermamson, G. T. . Bioconjugate techniques. , (1991).
- Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo. Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).
- Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires. Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).
- Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate. J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).
- Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus. Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).
- Natilla, A., Hammond, R. W. Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display. J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).
- Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route. Virology. 343, 2224-2235 (2005).
- Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus. Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).
- Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus. J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).
- Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
- Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology. Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).
