Análise da acessibilidade de solvente de resíduos de cisteína em<em> Milho rayado fino vírus</em> Partículas semelhantes a vírus produzidas em<em> Nicotiana benthamiana</em> Plantas e cross-linking de peptídeos para VLP
Summary
Um método para analisar a acessibilidade do solvente do grupo tiol de resíduos de cisteína de<em> Milho rayado fino vírus</em> (MRFV)-partículas semelhantes a vírus (VLPs), seguido por uma reacção de ligação cruzada de péptidos é descrito. O método tira partido da existência de grupos químicos sobre a superfície das partículas VLP, que podem ser alvos para as reacções específicas.
Abstract
Imitando e explorar as propriedades e características físico-químicas, vírus e física tem a promessa de fornecer soluções para alguns dos desafios mais prementes do mundo. A variedade e tipos de vírus, juntamente com suas propriedades intrigantes, potencialmente, dar oportunidades infinitas para aplicações em tecnologias baseadas em vírus. Vírus têm a capacidade de se auto-organizar em partículas com forma e tamanho discreto, a especificidade de simetria, polivalência e propriedades estáveis sob uma variedade de condições de temperatura e pH. Não surpreendentemente, com uma gama tão extraordinária de propriedades, os vírus são propostas para uso em biomateriais 9, 14, 15 vacinas, materiais eletrônicos, ferramentas químicas e molecular recipientes eletrônico 4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
A fim de utilizar os vírus em nanotecnologia, eles devem ser modificados a partir de suas formas naturais para conferir novas funções. Este pr desafiadorocesso pode ser realizada através de vários mecanismos, incluindo a modificação genética do genoma virai e a fixação de moléculas quimicamente estrangeiras ou desejado para as partículas de vírus grupos reactivos 8. A capacidade de modificar vírus principalmente depende das propriedades físico-químicas e físicas do vírus. Além disso, as modificações genéticas ou físico-química precisam ser executadas sem afectar adversamente a estrutura do vírus nativo e função do vírus. Maize rayado fino vírus proteínas (MRFV) revestimento auto-montar em Escherichia coli produtoras de VLPs estáveis e vazios que são estabilizadas por proteína-proteína interações e que pode ser usado em aplicações baseadas em tecnologias vírus 8. VLPs produzidas em plantas de tabaco foram examinados como um andaime sobre o qual uma grande variedade de péptidos pode ser covalentemente exibida 13. Aqui, descrevem-se as etapas de: 1) determinar quais as cisteínas solventes acessíveis em um capsídeo do vírus estão disponíveis para modificaçãocação, e 2) Bioconjugate péptidos aos capsídios modificados. Usando nativas ou mutationally-inserido resíduos de aminoácidos e as tecnologias de acoplamento normalizados, uma grande variedade de materiais tem sido apresentados na superfície de vírus de plantas, tais como, o vírus do mosaico Brome 3, vírus Carnation mottle 12, Cowpea cloróticas mottle virus 6, do mosaico do tabaco 17 vírus, o vírus do mosaico do nabo amarelo 1, e MRFV 13.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método aqui apresentado permite uma análise muito sensível e rápida de cisteínas reactivos presentes na superfície das plantas produzidas VLPs, bem como em outros complexos de proteínas. As maleimidas são específicas de reagentes de tiol, que reagem com o grupo sulfidrilo livre que contêm moléculas de modo a formar ligações tioéter estáveis. Este método baseia-se na especificidade das maleimidas para reagir com grupos sulfidrilo que não estão envolvidos em interacções com outros aminoácidos. A pre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| Thinwall, Ultra-Clear Tubes | Beckman | 344059 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 Kit | Life Tecnologies | AM1344M | |
| Fluorescein-5-Maleimide | Thermo Scientific Life Technologies | 46130 F150 | 46130 is out of order substitute with F150 |
| Pierce Biotin Quantitation Kit | Thermo Scientific | 28005 | |
| EZ-Link Maleimide-PEG2-Biotin, No-Weigh Format | Thermo Scientific | 21901 | |
| SM(PEG)n Crosslinkers | Thermo Scientific | 22107 | |
| 10-20% Tris-Glycine gel | Invitrogen | EC61352 | |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | 1610737 | |
| Tris Glycine SDS Running Buffer | Invitrogen | LC2675 | |
| Tris Glycine Transfer Buffer | Invitrogen | LC3675 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Phosphatase Labeled Affinity Purified Antibody to Rabbit IgG | Kirkegaard and Perry Laboratories | 0751516 | |
| NBT/BCIP Phosphatase Substrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 508107 |
References
- Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle. Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).
- Chapman, S., Kavanagh, T., Baulcombe, D. Potato virus X as a vector for gene expression in plants. Plant J. 2, 549-557 (1992).
- Chen, C., Kwak, E. S., Stein, B., Kao, C. C., Dragnea, B. Packaging of gold particles in viral capsids. J. Nanosci. Nanotechnol. 5, 2029-2033 (2005).
- Fowler, C. E., Shenton, W., Stubbs, G., Mann, S. Tobacco mosaic virus liquid crystals as templates for the interior design of silica mesophases and nanoparticles. Advanced Materials. 13, 1266-1269 (2001).
- Gazit, E. Use of biomolecular templates for the fabrication of metal nanowires. FEBS. J. 274, 317-322 (2007).
- Gillitzer, E., Wilts, D., Young, M., Douglas, T. Chemical modification of a viral cage for multivalent presentation. Chem. Commun. , 2390-2391 (2002).
- Hammond, R. W., Hammond, J. Maize rayado fino virus capsid proteins assemble into virus-like particles in Escherichia coli. Virus Res. 147, 208-215 (2010).
- Hermamson, G. T. . Bioconjugate techniques. , (1991).
- Kaiser, C. R., Flenniken, M. L., Gillitzer, E., Harmsen, A. L., Harmsen, A. G., Jutila, M. A., Douglas, T., Young, M. J. Biodistribution studies of protein cage nanoparticles demonstrate broad tissue distribution and rapid clearance in vivo. Int. J. Nanomed. 2, 715-733 (2007).
- Knez, M., Bittner, A. M., Boes, F., Wege, C., Jeske, H., Maisse, E., Kern, K. Biotemplate synthesis of 3-nm nickel and cobalt nanowires. Nano Lett. 3, 1079-1082 (2003).
- Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Effect of CuCl2 concentration on the aggregation and mineralization of Tobacco mosaic virus biotemplate. J. Colloid. Interface. Sci. 297, 554-560 (2006).
- Lvov, Y., Haas, H., Decher, G., Mohwald, H., Mikhailov, A., Mtchedlishvily, B., Morgunova, E., Vainshtein, B. Successive deposition of alternate layers of polyelectrolytes and a charged virus. Langmuir. 10, 4232-4236 (1994).
- Natilla, A., Hammond, R. W. Maize rayado fino virus virus-like particles expressed in tobacco plants: a new platform for cysteine selective bioconjugation peptide display. J. Virol. Methods. 178, 209-215 (2011).
- Rae, C. S., Khor, I. W., Wang, Q., Destito, G., Gonzalez, M. J., Singh, P., Thomas, D. M., Estrada, M. N., Powell, E., Finn, M. G., Manchester, M. Systemic trafficking of plant virus nanoparticles in mice via the oral route. Virology. 343, 2224-2235 (2005).
- Raja, K. S., Wang, Q., Gonzalez, M. J., Manchester, M., Johnson, J. E., Finn, M. G. Hybrid virus-polymer materials. Synthesis and properties of PEG-decorated Cowpea mosaic virus. Biomacromolecules. 4, 472-476 (2003).
- Royston, E., Lee, S. Y., Culver, J. N., Harris, M. T. Characterization of silica-coated Tobacco mosaic virus. J. Colloid Interface Sci. 298, 706-712 (2006).
- Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification in the Tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
- Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology. Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).
