免疫沈降およびアシル-ビオチン所（阿部）による培養海馬神経細胞におけるタンパク質パルミトイル化の検出

1。初代培養海馬ニューロンから標的タンパク質の抽出プロテアーゼ阻害剤、原発海馬細胞からの内因性タンパク質を採取する前に、溶解緩衝液（ 表1 LB）を準備します。溶解緩衝液10mlに、10mMの最終濃度に0.1mlのフェニルメタンスルホニルフルオリド溶液（PMSF）を追加して、1プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤を追加します。 凍結乾燥粉末からN-エチルマレイミド（NEM）溶液（ 表1）を準備します 。穏やかに室温（RT）で100％EtOHに溶解する。常に実験の日のために新鮮なNEMの溶液を調製します。 次に溶解緩衝液およびNEMを兼ね備えています。新鮮な50mlコニカルチューブに2M NEMの溶液0.5mlを加える。 20ミリリットル上上のLB、および迅速な場所LBを追加する+ 4でロッキングプラットフォーム上NEM（50mmの最終濃度）℃が完全に5分間混合すること。常に正しく2を混在させるように、NEM / EtOHのソリューション第一及び第二のLBを追加します。 インキュベーターと氷*上の場所からの培養神経細胞を取り除きます。そっと携帯メディアを取り外し、ゆっくりと生理食塩水（PBS）1xをバッファリングされた冷リン酸で2回洗浄する。使い捨てセルリフターを使用して海馬ニューロン、およびスクレープ細胞の第一のウェルにLB + 50mMのNEMの300ミリリットルを追加します。細胞溶解物を収集し、そのグループの次のウェルにライセートを放電してください。セルリフターを使用して第2ウェル内の細胞をこすり落とし、収集し、さらに溶解液を濃縮するために必要に応じて、第3ウェルを用いて繰り返す。 あらかじめ冷却した（氷上）、1.5 mlマイクロチューブに細胞溶解液を収集します。残りの細胞溶解液を収集するためにLB + 50mMのNEMの100μlを用いて1.4の手順を繰り返します。溶液中に泡を吹かないように注意しながら、機械的な溶解を助けるために26半ゲージシリンジ5-6回通って全細胞溶解物を渡します。機器が使用可能な場合、一つではなく、氷の上で15秒間超音波処理することができます。 4℃、≥30分間細胞ライセートをうなだれるセルlysaを明確に16000×gでペレット非溶解細胞と界面活性剤不溶性の材料にするための/ 30分の遠心分離によってTE。 氷の上に新しい予め冷却し、1.5 mlチューブでクリア細胞ライセート（上清）を収集します。セルのすべてのグループの収穫のプロトコルを繰り返します。測定タンパク質BCAアッセイを使用して、すべてのライセート試料中の濃度、および500μgの推奨最小値で、正確に等しい総タンパク質を持っている細胞のグループからすべてのライセートサンプルの音量を正規化します。 500μlの全体積にLB + 50mMのNEMで、すべてのサンプルを補充して下さい。 溶解物サンプルのそれぞれに標的タンパク質に対して向け、一次抗体の1から5μgを追加します。一晩4抗体溶解液混合試料℃をうなだれる以前に5を用いて説明し、欲望のために成長したとして*初代ラット海馬ニューロンは、ニューロンのB27サプリメントを含む無血清培地中で、6ウェル皿に約250,000細胞/ウェルの密度で培養すべきである成熟度を達成するために、時間の長さdは、一般的に14から16日間·イン · ビトロ （DIV）。全タンパク質の500μgの最小は正常に免疫沈降し、通常6ウェル皿の2-3井戸を必要とするターゲット神経タンパク質をビオチン化することをお勧めします。 2。抗体が結合した標的タンパク質の沈殿標的タンパク質を沈殿させると固定化する前に、タンパク質、またはプロテインG-セファロースコーティングされたビーズの50％スラリーを準備します。具体的には、すべてのサンプルは、ビーズの同量を持っていることを確認し、1.5 mlチューブにサンプルあたりセファロースビーズの≥60μlを添加する。機器が使用可能な場合、磁性ビーズも適している。 各抗体溶解液試料に50％スラリーの等量を追加し、4℃で≥1時間うなだれる℃、 3。アシル-ビオチン為替：ヒドロキシルアミン（HAM）の胸の谷間手順2.2を実行している間、二の溶解緩衝液（LB）と管の数を準備fferentのpH。 pHは、これらの手順のために非常に重要であり、常にpHメーターを用いて調整されるべきである。 LBのサンプルあたりのpHは7.2、サンプルあたりの厳格なバッファ（ 表1）の0.5ミリリットルの2ミリリットルを用意します。また、ステップ1.1から1.3に示すように、サンプルあたり0.5 mlのLB + 10mMのNEMを準備します。ステップ1.1のように、すべての溶解バッファーにPMSFおよびプロテアーゼ阻害剤の錠剤を追加します。 ヒドロキシルアミン（HAM）とは、その開裂パルミチン酸のシステインからビオチン化（ 図1）に必要とされる強力な還元剤であり、HAMの切断の不作為は、ネガティブコントロールとして機能します。 2サンプル、HAMの切断工程（-HAM）を省略1、およびHAMステップ（+ HAM）などのいずれかにビーズの各サンプルを分割します。 HAMの治療によって引き起こされるタンパク質の分解のために正規化するには、1は、+、HAMの治療のために使用される-HAMの制御に使用されるビーズは、残りの2/3の1/3、3分割に各サンプルを分割する必要があります。 追加の準備1。各サンプルの-HAMコントロールとしてラベル氷上で5 mlチューブ、。ステップ2.2に続いて、穏やかに4℃（この速度、持続時間、特に断らない限り、すべての残りの手順のための温度で遠心分離機）で0.5 XG / 1分で、すべてのサンプル 'ビーズを遠心分離し、氷の上にチューブを配置し、上清を除去し、 LB + 10mMのNEMの600μlのビーズを再懸濁する。 溶解バッファー+ NEM 10mmの再懸サンプル "ビーズの後、直ちに氷上にそのサンプルの-HAMのチューブに200サンプルのライセートビーズスラリーの添加、および放電を収集します。各試料中の500μlの合計は、+ HAMサンプルにLB +-HAMサンプルに10mMのNEM、追加100μlの液追加300を追加します。氷上で10分間チューブをインキュベートする。 再懸濁する（洗う）-HAMと+ HAMサンプルそっと0.5ミリリットル厳しいバッファを持つ、サンプルあたり。長くSDSのインキュベーションはから結合した抗体の除去になりますように、迅速に、このステップを実行しビーズ。 そっとのLB液（pH7.2）を0.5ml /サンプルのすべてのサンプルを三回洗って、ステップ3.2bのように、洗浄の間にスピンダウンします。 ステップ3.5を実行している間、HAMバッファ（ 表1）を作成します 。 0.5ミリリットルのLB液（pH7.2）、一人当たり+ HAMの試​​料の体積の1Mの最終濃度を達成するために、新しいチューブにヒドロキシルアミン溶液の適切なボリュームを追加します。常に実験の日のために新鮮なHAMバッファを準備します。すべての-HAMサンプル、およびすべての+ HAMサンプルへHAM緩衝液0.5ml /サンプルにLBのpH 7.2の0.5ミリリットル/サンプルを追加します。 室温（RT）で1時間のすべてのサンプルをうなだれる。 1時間を超えないようにしてください。 4。アシル-ビオチン為替：ビオチン-BMCCラベリングステップ3.6を実行している間は、ステップ3.1のように、サンプルあたりのLB pHを6.2（ 表1）、2 mlを準備します。必要になるまで氷上でのLB pHを6.2に配置します。また、使用直前にビオチン-BMCC（ 表1）のストック溶液を調製します。 exacを秤量ビオチン-BMCCのTLY 2.1ミリグラム、1.5 mlチューブに集め、ゆっくりと8mmの濃度を（粉を分割するピペットを使用していない達成するために、RTでロッキングプラットフォーム上に配置することにより、0.5ミリリットルジメチルスルホキシド（DMSO）に溶解）。 3.6ステップが完了すると、静かに残留HAMバッファを削除するには、pHを6.2溶解バッファーで一度ビーズを洗浄。上清を除去し、サンプルを氷上に置きます。 ビオチン-BMCCはシステインの遊離チオール基（ 図1）に対して高い親和性を有する共役maliemideビオチン分子である。ステップ4.2を実行している間、5μM〜0.5μMの間の作業濃度のサンプルあたりのビオチン-BMCCバッファ（ 表1）、0.5mlの準備をします。 5μMの濃度を超える可能性が高い標的蛋白質6飽和し、典型的に超えてはならないが、これは所望の標的タンパク質に応じて異なる場合があります。各サンプルにビオチン-BMCC緩衝液0.5mlを追加し、＆4で丁度1時間うなだれる度、C. 1時間を超えないようにしてください。 5。ビオチン結合標的タンパク質とSDS-PAGEの溶出 4.3ステップが完了したら、優しくしたLB pHを6.2に一度、すべてのサンプルを洗う。洗浄の間に氷の上で、すべてのサンプルを保持します。 -20°C貯蔵から無還元剤（ 表1）と2×SDSサンプルバッファーを外し、ゆっくりと氷の上で解凍します。 ゆっくりしたLB（pH7.5）にサンプルを三回洗浄+ PMSF /阻害剤、および洗浄の間でサンプルを氷上で保管してください。 チューブの底に残っているバッファーでスラリー中に沈殿させたビーズを残して、第三の洗浄の上清を取り除きます。スラリーを通してチューブの一番下に小径チップ（ゲルローディングチップまたはP2ピペットチップでも十分です）とピペットを浸し、すぐに任意のビーズを取ることをしないように注意して、任意のバッファの残りのデータを収集します。 5mmの最終濃度を達成するために、DL-ジチオスレイトール（DTT）と2×SDSサンプルバッファーを補足するものです。加える2×サンプルバッファー40から50μL+各サンプルに5mMのDTT。必要であれば、渦ビーズが完全にサンプルバッファーと混合し、直ちに試料緩衝液中に浸漬ペレット内のすべてのビーズを収集するために高速で遠心する。 75から80℃で10分間、全てのサンプルを沸かす℃に完全にビーズを沈殿16,000≥10ベンチトップのmin、遠心XG / 3分間室温に冷却し、サンプルをみましょう。 西部は、SDS-PAGE 7を使用して 、ブロッティングに適したポリアクリルアミドゲル内の単一の車線に各試料から溶出されたタンパク質（上清）を完全にボリュームを追加します。単一サンプルの-HAM制御溶離液と+ハムの溶離液をSDS-PAGE（図2）の間にお互いにすぐ隣接して実行されるように、すべてのサンプルを整理します。 SDS-PAGE後、PVDFまたはニトロセルロース膜に移します。 6。ブロッティングと標的タンパク質のパルミトイル化の検出西部ステップ5.6が完了した後、メンブレンを洗浄2回に分けて、RTでロッキングプラットフォーム上で10分間生理食塩水（TBS 1x）をトリス緩衝。 TBS 1xのボリュームで3％の重量を達成するために、（BSA）、ウシ血清アルブミンを秤量することにより非特異的標識を遮断するブロッキングバッファーを準備+完全に水没膜をするのに十分であるTween-20を0.05％（TBS-T） 。ストレプトアビジンは、ブロッティングのために、常にBSAでブロックしていない粉ミルク。ロッキングプラットフォーム上で室温で1時間、膜をブロックします。 TBS-Tで+0.3％BSAの抗体溶液を調製します。ストレプトアビジン-H​​RP抗体追加1:5,000-1:10,000で希釈し、蒸留水で1 mg / mlの、で再構成した。一度ステップ6.2が終了し、10分間、TBS-Tで一度メンブレンを洗浄し、4℃で一晩、室温で1時間のどちらかのためにロッキングプラットフォーム上でストレプトアビジン抗体溶液に膜をインキュベートするか、 ロッキングプラットフォーム上で10分間メンブレンをTBS-Tで3回洗浄する。パルミトイル化シグナルを検出するためには、化学を用いてHRPの発光を公開iluminescent基質キット。 免疫沈降させ、目的のタンパク質の量にパルミトイル化レベルを正常化するために、RTでロッキングプラットフォーム上で5〜10分間ウェスタンブロットストリッピングバッファーを用いた膜を取り除くことにしました。もともと免疫沈降のために使用された目的のタンパク質に対する一次抗体を用いて6.4 – 6.1の手順を繰り返します。 画像解析ソフトウェアを使用して、目的のタンパク質のパルミトイル化を定量化し、免疫沈降したタンパク質の量にパルミトイル化レベルを正規化します。